細胞凍存是細胞保存的主要方法之一。利用凍存技術將細胞置于 - 196℃液氮中低溫保存，可以使細胞暫時脫離生長狀態而將其細胞特性保存起來，這樣在需要的時候再復蘇細胞用于實驗。而且適度地保存一定量的細胞，可以防止因正在培養的細胞被污染或其他意外事件而使細胞丟種，起到了細胞保種的作用。


一、原理
在不加任何條件下直接凍存細胞時，細胞內和外環境中的水都會形成冰晶，能導致細胞內發生機械損傷、電解質升高、滲透壓改變、脫水、PH 改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡。如向培養液加入保護劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結條件下，能使細胞內水份在凍結前透出細胞。貯存在－130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。
細胞復蘇時速度要快，使之迅速通過細胞易受損的－5～0℃，細胞仍能生長，活力受損不大。
目前常用的保護劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對細胞無-毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞。

二、細胞凍存與復蘇操作步驟
（一）凍存
1、消化細胞（同實驗二），將細胞懸液收集至離心管中。
2、1000rpm 離心 10 分鐘，棄上清液。
3、沉淀加含保護液的培養，計數，調整至 5×106/ml 左右。
4、將懸液分至凍存管中，每管 1 ml。
5、將凍存管口封嚴。如用安瓿瓶則火焰封口，封口一定要嚴，否則復蘇時易出現爆裂。
6、貼上標簽，寫明細胞種類，凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細繩。
7、按下列順序降溫：室溫→4℃（20 分鐘)→冰箱冷凍室（30 分鐘）→低溫冰箱 (－30℃ 1 小時）→氣態氮（30 分鐘）→液氮。
注意：操作時應小心，以免液氮凍傷。液氮定期檢查，隨時補充，不能揮發干凈，一般 30 立升的液氮能用 1～1.5 月。

（二）復蘇
1.  細胞實驗室進行常規消毒，紫外照射 40min 以上。
2.  培養液（DMEM）、0.25％胰蛋白酶（Trypsin）恒溫水浴箱 37°C 預熱 20min，備用。
3.  二甲基亞砜（DMSO) 在 40°C 冰箱中冷藏 30min，備用。
4.  從液氮保存罐中取出凍存管，立即放入 400°C 水浴中，快速搖晃，直至凍存液完全融化。
5.  將細胞懸液移入 15ml 離心管，緩慢加入 4ml 培養液，離心（1000r/min，5min）。
6.  用培養液懸液混懸沉淀細胞，調整細胞濃度，方培養箱中培養。

7.  記錄復蘇日期。
三、注意事項
1.  取細胞的過程中注意帶好防凍手套，護目鏡。此項尤為重要，細胞凍存管可能漏入液氮，解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，可導致爆炸。
2.  凍存液的問題：凍存液的配置已是常識，在這里不作詳述，但二甲基亞砜（DMSO）對細胞不是完全無-毒副作用，在常溫下，二甲基亞砜對細胞的毒副作 較大，因此，必須在 1-2min 內使凍存液完全融化。如果復蘇溫度太慢，會造成細胞的損傷，二甲基亞砜（DMSO）選擇進口產品。
3.  離心前須加入少量培養液。細胞解凍后二甲基亞砜濃度較高，注意加入少量培養液可稀釋其濃度，以減少對細胞的損傷。
4.  離心問題：目前主要有兩種見解。一種是解凍后的細胞懸液直接吹打均勻后分裝到培養瓶中進行培養，第二天換液。因為離心的目的是兩個，去除 DMSO，去除死細胞，這個是標準流程，但對一般人來說，把握不好離心轉速和時間，轉的不夠活細胞沉底的少，細胞就全被扔掉了，轉過了活細胞會受壓過大， 死亡。此外在操作過程中容易污染，所以不推薦。另一種說法為細胞懸液中含有二甲基亞砜（DMSO），DMSO 對細胞有一定的毒副作用，所以須將離心后的液 體前倒凈，且一定倒干凈。我在試驗中按照常規的離心分裝的方法進行復蘇，結果無有異常。
5.  細胞貼壁少的問題：教科書中說明凍存細胞解凍時 1ml 細胞液要加 10ml－15m 培養液，而在我的試驗中的經驗總結為培養基越少細胞越容易貼附。
6.  復蘇細胞分裝的問題：試驗中我的經驗總結為復蘇 1 管細胞一般可分裝到 1-2 只培養瓶中，分裝過多，細胞濃度過低，不利于細胞的貼壁。
7.  加培養基的量放入問題：這個量的多少的把握主要涉及到的問題是 DMSO 的濃度，從如果你加培養基的太少，那么 DMSO 的濃度就會比較大，就會影響 細胞生長，從以前的資料來看，DMSO 的濃度在小于 0.5% 的時候對一般細胞沒有什么影響，還有一個說法是 1％。所以如果你的凍存液的濃度是 10％DMSO 的話那么加 10ml 以上的培養基就恰好稀釋到了無害濃度