常用菌種的保藏方法有哪些
菌種，多是指國家的幾個菌種保藏中心的成品菌種，在液氮狀態下，盛放在安瓿管中。企業生產按國家要求，必須要國家的菌保中心購買菌種，不得采用外來菌種。
一、常用菌種保藏方法
1、菌種保藏原理
根據微生物的菌種生理、生化特性，在人工創造的條件下盡量降低微生物細胞的代謝強度，使細胞基本處于休眠狀態，生長繁殖受到抑制但又不至于死亡，以減低菌種的變異率。低溫、干燥、缺氧、缺乏營養等環境條件都有抑制微生物的代謝作用。
低溫、干燥、真空是用于菌種保藏的重要手段。選擇保藏方法時，首先應考慮方法能否長期地保持菌種原有的特性，同時也應兼顧到方法的經濟和簡便。在實際工作中，往往多種條件同時使用，以提高保藏效果。
2、菌種保藏步驟
①挑選特征典型的純菌菌落；
②確定保藏的合適菌體形態；
③選擇zui適宜的保藏方法；
④定期對保藏菌種進行檢查，觀察是否發生變化，若有變化，須改變保藏方法，保藏期滿應及時進行移種；
3、瓊脂斜面低溫保存法
（1）方法：
將經常使用的菌種的典型菌落接種在斜面（某些特殊菌種可用液體培養基）上，按規定的溫度和時間培養，待充分生長后，把培養好的新鮮菌種用牛皮紙保好，為減緩培養基的水分蒸發，延長保藏時間，可將菌種保藏管的棉花塞換成橡膠塞。放在4℃左右的冰箱中保藏。每隔 2~3個月移種一次，繼續進行保藏。若用半固體高層培養基穿刺培養，一般可保藏半年——一年。有的甚至geng長時間。
（2）適用范圍：細菌、酵母菌、霉菌保藏。
（3）特點：
優點是——簡便，易于推廣；一般不需要另選擇保藏用培養基；對大多數微生物都適用；
缺點是——保藏期太短；傳代次數多，易發生變異及污染。
（4）注意事項：
保藏的菌種應是生命活力旺盛的新鮮培養物，至少應是第三代的培養物。
保藏時，破傷風桿菌可用庖肉培養基；生孢梭菌用流體硫乙醇酸鹽培養基。必須定期檢查保藏菌種冰箱的溫度、濕度以及菌種管的棉塞是否松動或生霉，如有異常應及時處理。
每次移植后，應與原菌種的編號、名稱逐一核對，確證培養基特征和純度無誤后再繼續保藏。
保藏菌種的培養基應無糖，其他菌類含糖小于2 %為宜，以免產酸過多，影響菌種存活。
銅綠假單胞菌在冰箱中易發生菌體自溶而死亡，不宜用本法保存。
4、液體石蠟保存法
本法是用石蠟將培養物與空氣隔絕，以降低菌種的生理生化水平，并可防止水分蒸發，從而延長菌種的保藏期：
（1）方法
將菌種接種于斜面或穿刺于0.3~0.5 %瓊脂半固體高層培養基中，培養好備用。取化學純的液體石蠟裝在試管中，每管10~15mL，加棉塞，瓶口包上紙，121℃高壓滅菌30min，取出置37℃溫箱或110~ 170℃烤箱中1 ~ 2h或干燥器內除去液體石蠟中的水分。
將上述液體石蠟加入培養好的菌種試管內，液體石蠟液面以高出培養基zui上端1㎝為宜，將試管直立，放入4℃冰箱中保藏。
（2）適用范圍：適用于保藏部分霉菌，酵母菌和放線菌，對細菌保藏效果較差。
（3）特點：本方法簡便易行，是實驗室常用的一種保藏方法，該法主要使菌種與空氣隔絕。
（4）注意事項：
①保藏時，用新鮮培養物接種，應檢查純度和特征后，方可進行保藏；
②保藏過程中，需經常觀察斜面是否干燥，如干燥，需重新移種；
③使用菌種時，先將菌種管傾斜使液體石蠟流至一邊，再用接種針挑取培養物接種到新鮮斜面上培養，待長出新培養物后，再移種一次到新斜面上即可使用；
④將沾有少量液體石蠟的接種針浸于95%酒精中片刻，再燒灼滅菌，以免直接在酒精燈下燒灼時，液體石蠟四濺，引起污染；
⑤液體石蠟在菌種管中高出培養基的高度要嚴格控制，如太多，會影響菌種交換氣體，使保藏效果不好；如太少，斜面容易干燥，將縮短保藏期。一般以高出斜面1cm為宜；
⑥制備無菌液體石蠟時，每管裝量不能太多，否則分裝到菌種培養基中易造成污染。
二、菌種的復蘇與保存
菌種的復蘇與保存應在專用超凈工作臺或生物安全柜內進行。
1、菌種的復蘇
把凍干菌種管、滅菌1mL滴管、雙碟、鑷子、營養肉湯培養基、營養瓊脂斜面數支，移入超凈工作臺或生物安全柜。
先用砂輪將凍干菌種安瓶頸部挫出刻痕，再將凍干菌種管外壁用dian酒擦洗消毒、稍干，用75%乙醇棉擦凈，放在滅菌雙碟內，待干。點燃酒精燈，將菌種管的封口一端在火焰上，燒灼紅熱，用滅菌滴管吸取營養肉湯培養基，滴在灼熱的菌種管封口一端，使驟冷而炸裂。
取滅菌鑷子，在火焰旁，將炸裂的管口打開，放入滅菌雙碟內，另取1支滅菌滴管，在火焰旁吸取營養肉湯少許，加至菌種管底部，將凍干菌攪動促使溶解，隨即吸出管內菌液，分別接種至營養瓊脂斜面及普通肉湯內，并將滴管及菌種管投入消毒液內，將已接種的營養肉湯及營養瓊脂斜面置35~37℃培養22~24h。
取出培養物，仔細觀察菌苔形態、有無雜菌、涂片、革蘭氏染色鏡檢，呈典型菌落后，轉種3代即可應用。如發現菌型不典型，可進行平板分離單菌落。
2、菌種的傳代與保存
方法1：菌斜面（保存）
培養基應新鮮制備，如斜面已無冷凝水者，不宜再使用。標簽上注明菌名及接種日期。
至冰箱取出的菌種斜面，應在室溫放置約30分鐘，待溫度平衡后再移入接種室或超凈工作臺。
點燃酒精燈，用左手握住菌種斜面，將管口靠進火焰旁，右手拿接種棒后端，將接種環燒紅30秒，隨后將全部接種棒金屬部分在火焰上燒灼，往返通過3次。左手將管口在火焰上旋轉燒灼，右手用無名指、小指及掌部夾住棉塞，撥開棉塞，將接種環伸人管內先在近壁的瓊脂斜面上靠一下，稍冷卻再移至菌苔上，刮去少量菌苔，隨即取出接種棒，并將菌種管口移至火焰旁。
堵上棉塞，左手將菌種管放下，取營養瓊脂斜面1支，照上述操作打開棉塞，將接種環伸入管內至瓊脂斜面的低部，由底向上，將接種環輕貼斜面的表面曲折移動，使細菌劃在斜面的表面上。
取出接種棒，在火焰旁將培養基管棉塞堵上，然后將接種過細菌的接種棒在火焰上燒灼滅菌。
將已接種畢的細菌管置35~37℃培養22~24小時，霉菌管一般置20~25℃霉菌培養箱內培養7日。取出后放人冰箱保存，一般 3個月轉種一次。
方法2：菌斜面-營養肉湯-分離平板-菌斜面
如果菌落形態不典型可純化，按下列方法傳代（分離菌落）：用接種環取上述菌管（斜面）菌苔少許接種置營養肉湯中(5mL/支，已滅菌)，置35~37℃培養18~24小時后，再用接種環取培養好的營養肉湯菌懸液（濃菌液），接種于分離平板，置35~37℃培養18~24小時，用接種針選典型菌落劃線于營養瓊脂斜面，置35~37℃培養18~24小時。一般同時接種幾支管，其中一支用于以后菌種傳代或接種到半固體瓊脂培養基中，其它用做工作菌種。
常用分離平板包括：大腸埃希菌——EMB瓊脂平板；銅綠假單胞菌——溴化十六烷三甲銨瓊脂培養基；金黃色葡萄球菌——甘露醇氯化鈉瓊脂培養基。
3、菌懸液的制備
取上述培養好的菌種斜面移入超凈工作臺或生物安全柜，放置室溫后，用接種環取菌苔少許接種置營養肉湯中(5mL/支，已滅菌), 將已接種畢的細菌管置35~37℃培養18~24小時，取出備用。
一般于冰箱中保存可用7天。
4、對照用菌液制備
取上述培養好的營養肉湯菌懸液（濃菌液1mL，加到9mL，0.9%無菌氯化鈉溶液混勻，為10-1，再取另一只吸管吸取10-1菌液1mL加到9mL，0.9%無菌氯化鈉溶液混勻，為10-2……以此類推，稀釋至含活菌數在50 ~ 100個。用平板計數。
此稀釋菌液用于試驗后加陽性對照，可在1天內使用。
5、菌種保管
菌種保管應有專人負責，保存與加鎖的冰箱中或特制的白鐵箱中加鎖置陰暗處，確保菌種安全。因工作變動時，必須做好交接工作。菌種應有詳細登記本，包括名稱、分離日期、鑒定日期、鑒定者、主要鑒定性能，并注意記錄使用、轉移及銷毀情況和原因。各種菌種應按規定時間定期移種。一般每移種3次后作一次全面鑒定。注意菌種有無污染和變異，如，發現污染和變異時，應及時geng換。購置菌種，應有介紹信。全部保存菌種應具備清單，并定期向部門負責人報告
一、常用菌種保藏方法
1、菌種保藏原理
根據微生物的菌種生理、生化特性，在人工創造的條件下盡量降低微生物細胞的代謝強度，使細胞基本處于休眠狀態，生長繁殖受到抑制但又不至于死亡，以減低菌種的變異率。低溫、干燥、缺氧、缺乏營養等環境條件都有抑制微生物的代謝作用。
低溫、干燥、真空是用于菌種保藏的重要手段。選擇保藏方法時，首先應考慮方法能否長期地保持菌種原有的特性，同時也應兼顧到方法的經濟和簡便。在實際工作中，往往多種條件同時使用，以提高保藏效果。
2、菌種保藏步驟
①挑選特征典型的純菌菌落；
②確定保藏的合適菌體形態；
③選擇zui適宜的保藏方法；
④定期對保藏菌種進行檢查，觀察是否發生變化，若有變化，須改變保藏方法，保藏期滿應及時進行移種；
3、瓊脂斜面低溫保存法
（1）方法：
將經常使用的菌種的典型菌落接種在斜面（某些特殊菌種可用液體培養基）上，按規定的溫度和時間培養，待充分生長后，把培養好的新鮮菌種用牛皮紙保好，為減緩培養基的水分蒸發，延長保藏時間，可將菌種保藏管的棉花塞換成橡膠塞。放在4℃左右的冰箱中保藏。每隔 2~3個月移種一次，繼續進行保藏。若用半固體高層培養基穿刺培養，一般可保藏半年——一年。有的甚至geng長時間。
（2）適用范圍：細菌、酵母菌、霉菌保藏。
（3）特點：
優點是——簡便，易于推廣；一般不需要另選擇保藏用培養基；對大多數微生物都適用；
缺點是——保藏期太短；傳代次數多，易發生變異及污染。
（4）注意事項：
保藏的菌種應是生命活力旺盛的新鮮培養物，至少應是第三代的培養物。
保藏時，破傷風桿菌可用庖肉培養基；生孢梭菌用流體硫乙醇酸鹽培養基。必須定期檢查保藏菌種冰箱的溫度、濕度以及菌種管的棉塞是否松動或生霉，如有異常應及時處理。
每次移植后，應與原菌種的編號、名稱逐一核對，確證培養基特征和純度無誤后再繼續保藏。
保藏菌種的培養基應無糖，其他菌類含糖小于2 %為宜，以免產酸過多，影響菌種存活。
銅綠假單胞菌在冰箱中易發生菌體自溶而死亡，不宜用本法保存。
4、液體石蠟保存法
本法是用石蠟將培養物與空氣隔絕，以降低菌種的生理生化水平，并可防止水分蒸發，從而延長菌種的保藏期：
（1）方法
將菌種接種于斜面或穿刺于0.3~0.5 %瓊脂半固體高層培養基中，培養好備用。取化學純的液體石蠟裝在試管中，每管10~15mL，加棉塞，瓶口包上紙，121℃高壓滅菌30min，取出置37℃溫箱或110~ 170℃烤箱中1 ~ 2h或干燥器內除去液體石蠟中的水分。
將上述液體石蠟加入培養好的菌種試管內，液體石蠟液面以高出培養基zui上端1㎝為宜，將試管直立，放入4℃冰箱中保藏。
（2）適用范圍：適用于保藏部分霉菌，酵母菌和放線菌，對細菌保藏效果較差。
（3）特點：本方法簡便易行，是實驗室常用的一種保藏方法，該法主要使菌種與空氣隔絕。
（4）注意事項：
①保藏時，用新鮮培養物接種，應檢查純度和特征后，方可進行保藏；
②保藏過程中，需經常觀察斜面是否干燥，如干燥，需重新移種；
③使用菌種時，先將菌種管傾斜使液體石蠟流至一邊，再用接種針挑取培養物接種到新鮮斜面上培養，待長出新培養物后，再移種一次到新斜面上即可使用；
④將沾有少量液體石蠟的接種針浸于95%酒精中片刻，再燒灼滅菌，以免直接在酒精燈下燒灼時，液體石蠟四濺，引起污染；
⑤液體石蠟在菌種管中高出培養基的高度要嚴格控制，如太多，會影響菌種交換氣體，使保藏效果不好；如太少，斜面容易干燥，將縮短保藏期。一般以高出斜面1cm為宜；
⑥制備無菌液體石蠟時，每管裝量不能太多，否則分裝到菌種培養基中易造成污染。
二、菌種的復蘇與保存
菌種的復蘇與保存應在專用超凈工作臺或生物安全柜內進行。
1、菌種的復蘇
把凍干菌種管、滅菌1mL滴管、雙碟、鑷子、營養肉湯培養基、營養瓊脂斜面數支，移入超凈工作臺或生物安全柜。
先用砂輪將凍干菌種安瓶頸部挫出刻痕，再將凍干菌種管外壁用dian酒擦洗消毒、稍干，用75%乙醇棉擦凈，放在滅菌雙碟內，待干。點燃酒精燈，將菌種管的封口一端在火焰上，燒灼紅熱，用滅菌滴管吸取營養肉湯培養基，滴在灼熱的菌種管封口一端，使驟冷而炸裂。
取滅菌鑷子，在火焰旁，將炸裂的管口打開，放入滅菌雙碟內，另取1支滅菌滴管，在火焰旁吸取營養肉湯少許，加至菌種管底部，將凍干菌攪動促使溶解，隨即吸出管內菌液，分別接種至營養瓊脂斜面及普通肉湯內，并將滴管及菌種管投入消毒液內，將已接種的營養肉湯及營養瓊脂斜面置35~37℃培養22~24h。
取出培養物，仔細觀察菌苔形態、有無雜菌、涂片、革蘭氏染色鏡檢，呈典型菌落后，轉種3代即可應用。如發現菌型不典型，可進行平板分離單菌落。
2、菌種的傳代與保存
方法1：菌斜面（保存）
培養基應新鮮制備，如斜面已無冷凝水者，不宜再使用。標簽上注明菌名及接種日期。
至冰箱取出的菌種斜面，應在室溫放置約30分鐘，待溫度平衡后再移入接種室或超凈工作臺。
點燃酒精燈，用左手握住菌種斜面，將管口靠進火焰旁，右手拿接種棒后端，將接種環燒紅30秒，隨后將全部接種棒金屬部分在火焰上燒灼，往返通過3次。左手將管口在火焰上旋轉燒灼，右手用無名指、小指及掌部夾住棉塞，撥開棉塞，將接種環伸人管內先在近壁的瓊脂斜面上靠一下，稍冷卻再移至菌苔上，刮去少量菌苔，隨即取出接種棒，并將菌種管口移至火焰旁。
堵上棉塞，左手將菌種管放下，取營養瓊脂斜面1支，照上述操作打開棉塞，將接種環伸入管內至瓊脂斜面的低部，由底向上，將接種環輕貼斜面的表面曲折移動，使細菌劃在斜面的表面上。
取出接種棒，在火焰旁將培養基管棉塞堵上，然后將接種過細菌的接種棒在火焰上燒灼滅菌。
將已接種畢的細菌管置35~37℃培養22~24小時，霉菌管一般置20~25℃霉菌培養箱內培養7日。取出后放人冰箱保存，一般 3個月轉種一次。
方法2：菌斜面-營養肉湯-分離平板-菌斜面
如果菌落形態不典型可純化，按下列方法傳代（分離菌落）：用接種環取上述菌管（斜面）菌苔少許接種置營養肉湯中(5mL/支，已滅菌)，置35~37℃培養18~24小時后，再用接種環取培養好的營養肉湯菌懸液（濃菌液），接種于分離平板，置35~37℃培養18~24小時，用接種針選典型菌落劃線于營養瓊脂斜面，置35~37℃培養18~24小時。一般同時接種幾支管，其中一支用于以后菌種傳代或接種到半固體瓊脂培養基中，其它用做工作菌種。
常用分離平板包括：大腸埃希菌——EMB瓊脂平板；銅綠假單胞菌——溴化十六烷三甲銨瓊脂培養基；金黃色葡萄球菌——甘露醇氯化鈉瓊脂培養基。
3、菌懸液的制備
取上述培養好的菌種斜面移入超凈工作臺或生物安全柜，放置室溫后，用接種環取菌苔少許接種置營養肉湯中(5mL/支，已滅菌), 將已接種畢的細菌管置35~37℃培養18~24小時，取出備用。
一般于冰箱中保存可用7天。
4、對照用菌液制備
取上述培養好的營養肉湯菌懸液（濃菌液1mL，加到9mL，0.9%無菌氯化鈉溶液混勻，為10-1，再取另一只吸管吸取10-1菌液1mL加到9mL，0.9%無菌氯化鈉溶液混勻，為10-2……以此類推，稀釋至含活菌數在50 ~ 100個。用平板計數。
此稀釋菌液用于試驗后加陽性對照，可在1天內使用。
5、菌種保管
菌種保管應有專人負責，保存與加鎖的冰箱中或特制的白鐵箱中加鎖置陰暗處，確保菌種安全。因工作變動時，必須做好交接工作。菌種應有詳細登記本，包括名稱、分離日期、鑒定日期、鑒定者、主要鑒定性能，并注意記錄使用、轉移及銷毀情況和原因。各種菌種應按規定時間定期移種。一般每移種3次后作一次全面鑒定。注意菌種有無污染和變異，如，發現污染和變異時，應及時geng換。購置菌種，應有介紹信。全部保存菌種應具備清單，并定期向部門負責人報告
