酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)方法原理：
本法首-先也是用特異性抗體包被于固相載體，經(jīng)洗滌后加入含有抗原之待測(cè)樣品，如待檢樣品中有相應(yīng)抗原存在，即可與包被于固相載體上的特異性抗體結(jié)合，經(jīng)保溫孵育洗滌后，即可加入酶標(biāo)記特異性抗體，再經(jīng)孵育洗滌后，加底物顯色進(jìn)行測(cè)定，底物降解的量即為欲測(cè)抗原的量。
這種方法欲測(cè)的抗原必須有兩個(gè)可以與抗體結(jié)合的部位，因?yàn)槠湟欢艘挥诠滔噍d體上的抗體作用，而另一端則要與酶標(biāo)記特異性抗體作用。因此，不能用于分子量小于5000的半抗原之類的抗原測(cè)定。我們用在霍亂腸毒素的測(cè)定。HbSAg及HbS的測(cè)定。
實(shí)驗(yàn)材料：血清 血漿 體液
試劑、試劑盒：碳酸鹽包被緩沖液 抗體球蛋白 吐溫 檸檬酸 硫酸
儀器、耗材：酶標(biāo)比色計(jì) 96孔板 移液槍 離心管 離心管盒
實(shí)驗(yàn)步驟：
一、包被抗體：用包被緩沖液稀釋特異性抗體球蛋白至zui適濃度（1～10 ug /ml），每凹孔加0.3 ml，4℃過夜，或37℃水浴3小時(shí)，貯存冰箱。
二、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。
三、每凹孔加入0.2 ml用稀釋緩沖液稀釋的含抗原的被檢標(biāo)本，37℃作用1～2小時(shí)。
四、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。
五、加入0.2 ml用稀釋緩沖液稀釋的酶標(biāo)記特異性抗體溶液，37℃作用1～2小時(shí)或由預(yù)試實(shí)驗(yàn)確定作用時(shí)間。
六、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。
七、加入0.2ml底物溶液于每個(gè)凹孔(OPD或OT)，室溫作用30分鐘（另作一空白對(duì)照，0.4 ml底物加0.1 ml終止劑）。
八、加終止劑：每凹孔加2M H2SO4或2 M檸檬酸0.05 ml。
九、觀察記錄結(jié)果：目測(cè)或用酶標(biāo)比色計(jì)測(cè)定（OPD用492nm）OD值。
注意事項(xiàng)：
1.可溶性抗原或抗體吸附于固相載體而成為不溶形式，這是進(jìn)行酶標(biāo)記測(cè)定的基本條件。許多物質(zhì)可作為固相載體，如纖維素、交聯(lián)右旋糖苷、瓊脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙-烯、聚乙-烯及聚氯乙-烯等等。但在ELISA中zui-常用的是聚苯乙-烯或聚氯乙-烯微量反應(yīng)板及塑料管。
2.包被所用的抗原必須是可溶性的，而且要求是優(yōu)質(zhì)和穩(wěn)定的制劑，純度和免疫原性要高。如果不純，由于抗原中所含雜質(zhì)就會(huì)競(jìng)爭(zhēng)固相載體上的有限位置，降低敏感性和特異性。此外還應(yīng)考慮到制備包被抗原不應(yīng)破壞其免疫學(xué)活性。
3.對(duì)某些抗原必須進(jìn)行提純，如病毒的組織培養(yǎng)和雞胚培養(yǎng)物以及病毒接種動(dòng)物的臟器等，它們當(dāng)中存在著許多非抗原的蛋白質(zhì)，必須設(shè)法除去，常用梯度超速離心或親和層析法提純，不經(jīng)提純是不能使用的。
4.用zui適稀釋度抗原，包被固相載體不僅經(jīng)濟(jì)，而且可以克服前帶現(xiàn)象。可通過棋盤滴定法進(jìn)行測(cè)定，但用單項(xiàng)滴定法geng為簡(jiǎn)便，其方法是將抗原進(jìn)行一系列稀釋包被微量反應(yīng)板，再用一定稀釋度的陽(yáng)性參考血清和陰性參考血清進(jìn)行孵育后洗滌，再加酶結(jié)合物進(jìn)行反應(yīng)，經(jīng)孵育洗滌后，加底物溶液顯色，終止反應(yīng)后分別測(cè)定OD值，選擇OD值≥1.0的那個(gè)抗原稀釋度為zui適包被濃度。一般總是要選擇那個(gè)OD值稍大于1.0，而不選擇小于1.0的抗原濃度。陰性參考血清OD值要求<0.1-0.2。也就是要求陽(yáng)性參考血清和陰性參考血清的OD值有明顯差別。
5.抗原包被固相載體除濃度外，對(duì)時(shí)間、溫度、PH均有關(guān)系。溫度高（如37℃、45℃、或56℃），包被時(shí)間可縮短，溫度低可延長(zhǎng)包被時(shí)間。但為了方便起見，通常采用4℃包被過夜，可使抗原吸附得geng加完全且均勻。在用聚苯乙-烯或聚乙-烯微量反應(yīng)板或塑料管作固相載體時(shí)，在堿性條件下（如0.1 mol/L、PH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋抗原）4℃包被過夜較為合適。但在某些試驗(yàn)中，如用LPS或毒素蛋白包被時(shí)，用PH 7.2-7.4 PBS稀釋才是滿意的。包被特異蛋白質(zhì)的濃度為1-10 ug/ml，而對(duì)某些病原微生物抗原以5-20 ug/ml較為合適，但均應(yīng)通過滴定。
本法首-先也是用特異性抗體包被于固相載體，經(jīng)洗滌后加入含有抗原之待測(cè)樣品，如待檢樣品中有相應(yīng)抗原存在，即可與包被于固相載體上的特異性抗體結(jié)合，經(jīng)保溫孵育洗滌后，即可加入酶標(biāo)記特異性抗體，再經(jīng)孵育洗滌后，加底物顯色進(jìn)行測(cè)定，底物降解的量即為欲測(cè)抗原的量。
這種方法欲測(cè)的抗原必須有兩個(gè)可以與抗體結(jié)合的部位，因?yàn)槠湟欢艘挥诠滔噍d體上的抗體作用，而另一端則要與酶標(biāo)記特異性抗體作用。因此，不能用于分子量小于5000的半抗原之類的抗原測(cè)定。我們用在霍亂腸毒素的測(cè)定。HbSAg及HbS的測(cè)定。
實(shí)驗(yàn)材料：血清 血漿 體液
試劑、試劑盒：碳酸鹽包被緩沖液 抗體球蛋白 吐溫 檸檬酸 硫酸
儀器、耗材：酶標(biāo)比色計(jì) 96孔板 移液槍 離心管 離心管盒
實(shí)驗(yàn)步驟：
一、包被抗體：用包被緩沖液稀釋特異性抗體球蛋白至zui適濃度（1～10 ug /ml），每凹孔加0.3 ml，4℃過夜，或37℃水浴3小時(shí)，貯存冰箱。
二、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。
三、每凹孔加入0.2 ml用稀釋緩沖液稀釋的含抗原的被檢標(biāo)本，37℃作用1～2小時(shí)。
四、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。
五、加入0.2 ml用稀釋緩沖液稀釋的酶標(biāo)記特異性抗體溶液，37℃作用1～2小時(shí)或由預(yù)試實(shí)驗(yàn)確定作用時(shí)間。
六、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。
七、加入0.2ml底物溶液于每個(gè)凹孔(OPD或OT)，室溫作用30分鐘（另作一空白對(duì)照，0.4 ml底物加0.1 ml終止劑）。
八、加終止劑：每凹孔加2M H2SO4或2 M檸檬酸0.05 ml。
九、觀察記錄結(jié)果：目測(cè)或用酶標(biāo)比色計(jì)測(cè)定（OPD用492nm）OD值。
注意事項(xiàng)：
1.可溶性抗原或抗體吸附于固相載體而成為不溶形式，這是進(jìn)行酶標(biāo)記測(cè)定的基本條件。許多物質(zhì)可作為固相載體，如纖維素、交聯(lián)右旋糖苷、瓊脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙-烯、聚乙-烯及聚氯乙-烯等等。但在ELISA中zui-常用的是聚苯乙-烯或聚氯乙-烯微量反應(yīng)板及塑料管。
2.包被所用的抗原必須是可溶性的，而且要求是優(yōu)質(zhì)和穩(wěn)定的制劑，純度和免疫原性要高。如果不純，由于抗原中所含雜質(zhì)就會(huì)競(jìng)爭(zhēng)固相載體上的有限位置，降低敏感性和特異性。此外還應(yīng)考慮到制備包被抗原不應(yīng)破壞其免疫學(xué)活性。
3.對(duì)某些抗原必須進(jìn)行提純，如病毒的組織培養(yǎng)和雞胚培養(yǎng)物以及病毒接種動(dòng)物的臟器等，它們當(dāng)中存在著許多非抗原的蛋白質(zhì)，必須設(shè)法除去，常用梯度超速離心或親和層析法提純，不經(jīng)提純是不能使用的。
4.用zui適稀釋度抗原，包被固相載體不僅經(jīng)濟(jì)，而且可以克服前帶現(xiàn)象。可通過棋盤滴定法進(jìn)行測(cè)定，但用單項(xiàng)滴定法geng為簡(jiǎn)便，其方法是將抗原進(jìn)行一系列稀釋包被微量反應(yīng)板，再用一定稀釋度的陽(yáng)性參考血清和陰性參考血清進(jìn)行孵育后洗滌，再加酶結(jié)合物進(jìn)行反應(yīng)，經(jīng)孵育洗滌后，加底物溶液顯色，終止反應(yīng)后分別測(cè)定OD值，選擇OD值≥1.0的那個(gè)抗原稀釋度為zui適包被濃度。一般總是要選擇那個(gè)OD值稍大于1.0，而不選擇小于1.0的抗原濃度。陰性參考血清OD值要求<0.1-0.2。也就是要求陽(yáng)性參考血清和陰性參考血清的OD值有明顯差別。
5.抗原包被固相載體除濃度外，對(duì)時(shí)間、溫度、PH均有關(guān)系。溫度高（如37℃、45℃、或56℃），包被時(shí)間可縮短，溫度低可延長(zhǎng)包被時(shí)間。但為了方便起見，通常采用4℃包被過夜，可使抗原吸附得geng加完全且均勻。在用聚苯乙-烯或聚乙-烯微量反應(yīng)板或塑料管作固相載體時(shí)，在堿性條件下（如0.1 mol/L、PH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋抗原）4℃包被過夜較為合適。但在某些試驗(yàn)中，如用LPS或毒素蛋白包被時(shí)，用PH 7.2-7.4 PBS稀釋才是滿意的。包被特異蛋白質(zhì)的濃度為1-10 ug/ml，而對(duì)某些病原微生物抗原以5-20 ug/ml較為合適，但均應(yīng)通過滴定。
