蛋白質(zhì)紫外吸收與濃度測定方法
[原理]
由于蛋白質(zhì)中存在著含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白質(zhì)溶液在280nm處具有紫外吸收高峰。在一定濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液在此波長處的吸光度與其濃度呈正比關(guān)系，因此利用這一性質(zhì)可進行蛋白質(zhì)定量測定。
該法迅速、簡便、不消耗樣品、低濃度鹽類不干擾測定，可測定0.1～1.0mg/mL的蛋白質(zhì)溶液。
由于蛋白質(zhì)的紫外吸收高峰常因pH變化而改變，故應用此法時要注意溶液的pH。蕞好樣品的pH與標準曲線制定時的pH一致。
本法對于測定與標準蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質(zhì)誤差較大，故適用于測定與標準蛋白質(zhì)酪氨酸、色氨酸這類氨基酸含量相仿的樣品；若樣品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物質(zhì)，會出現(xiàn)較大干擾。
例如混有核酸，核酸可吸收波長為280nm的紫外光，但它對260nm紫外光吸收geng強。而蛋白質(zhì)恰恰相反，280nm的紫外吸收值大于260nm紫外吸收值。運用280/260吸收差法則可以適當校正核酸對蛋白質(zhì)濃度測定的干擾作用。
[方法與步驟]
1、標準曲線的制作
取7支試管，編號后按下表依次加入標準蛋白溶液和氫氧化鈉溶液。
加畢，攪勻，選用石英比色皿，用紫外 分光光度計 測A280。
以每管標準蛋白毫克數(shù)為橫坐標，對應的A280值為縱坐標，作標準曲線圖。
2、蛋白樣品測定
（1）標準曲線法
實驗中樣品可用牛奶中自制的酪蛋白溶液加0.1mol/L NaOH稀釋而成。
把樣品蛋白溶液裝入石英 比色皿 中，測A280，對照標準曲線求得蛋白質(zhì)濃度。
式中 n——從標準曲線上查出的酪蛋白毫克數(shù)。
（2）280nm與260nm吸收差法：
分別測定蛋白質(zhì)樣品在280nm、260nm處的吸收值，按下列公式計算蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。
蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（mg/ mL）=1.45 A280 - 0.74 A260式中 A280——蛋白質(zhì)溶液在280nm出測得的吸光度；A260——蛋白質(zhì)溶液在260nm出測得的吸光度。不同蛋白質(zhì)及核酸的光吸收率不完全相同，按此式計算仍可能產(chǎn)生誤差。
由于蛋白質(zhì)中存在著含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白質(zhì)溶液在280nm處具有紫外吸收高峰。在一定濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液在此波長處的吸光度與其濃度呈正比關(guān)系，因此利用這一性質(zhì)可進行蛋白質(zhì)定量測定。
該法迅速、簡便、不消耗樣品、低濃度鹽類不干擾測定，可測定0.1～1.0mg/mL的蛋白質(zhì)溶液。
由于蛋白質(zhì)的紫外吸收高峰常因pH變化而改變，故應用此法時要注意溶液的pH。蕞好樣品的pH與標準曲線制定時的pH一致。
本法對于測定與標準蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質(zhì)誤差較大，故適用于測定與標準蛋白質(zhì)酪氨酸、色氨酸這類氨基酸含量相仿的樣品；若樣品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物質(zhì)，會出現(xiàn)較大干擾。
例如混有核酸，核酸可吸收波長為280nm的紫外光，但它對260nm紫外光吸收geng強。而蛋白質(zhì)恰恰相反，280nm的紫外吸收值大于260nm紫外吸收值。運用280/260吸收差法則可以適當校正核酸對蛋白質(zhì)濃度測定的干擾作用。
[方法與步驟]
1、標準曲線的制作
取7支試管，編號后按下表依次加入標準蛋白溶液和氫氧化鈉溶液。
|
管號 試劑 |
0 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
|
標準蛋白溶液/mL |
0 |
0.5 |
1.0 |
1.5 |
2.0 |
2.5 |
3.0 |
|
0.1mol/L NaOH/mL |
4.0 |
3.5 |
3.0 |
2.5 |
2.0 |
1.5 |
1.0 |
加畢，攪勻，選用石英比色皿，用紫外 分光光度計 測A280。
以每管標準蛋白毫克數(shù)為橫坐標，對應的A280值為縱坐標，作標準曲線圖。
2、蛋白樣品測定
（1）標準曲線法
實驗中樣品可用牛奶中自制的酪蛋白溶液加0.1mol/L NaOH稀釋而成。
把樣品蛋白溶液裝入石英 比色皿 中，測A280，對照標準曲線求得蛋白質(zhì)濃度。
式中 n——從標準曲線上查出的酪蛋白毫克數(shù)。
（2）280nm與260nm吸收差法：
分別測定蛋白質(zhì)樣品在280nm、260nm處的吸收值，按下列公式計算蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。
蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（mg/ mL）=1.45 A280 - 0.74 A260式中 A280——蛋白質(zhì)溶液在280nm出測得的吸光度；A260——蛋白質(zhì)溶液在260nm出測得的吸光度。不同蛋白質(zhì)及核酸的光吸收率不完全相同，按此式計算仍可能產(chǎn)生誤差。
