免疫組化實驗常見問題處理 @古朵生物
當免疫組化染色沒有出現(xiàn)預期結果時，應系統(tǒng)地查找原因，而每一次只能排除一種可能的原因。
對照/標本無染色
①確認是否忽略了應該加的某種試劑，包括一抗、二抗、三抗及底物等。
②確認所有的試劑是否按正確的順序加入，是否孵育了足夠的時間。
③對照抗體的標簽確認是否使用了正確的抗體，以及所用的檢測系統(tǒng)是否和一抗匹配，這一點是非常重要的。比如，如果一抗是兔來源的抗體，二抗一定要用抗兔的二抗來匹配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必須是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。
④檢查抗體所使用的稀釋度及稀釋溶液。
⑤檢查抗體的有效期和保存條件，尤其是標記了酶或熒光素的抗體，現(xiàn)在大多數(shù)試劑公司的抗體均要求在4~8℃條件下保存，應避免反復凍融，試劑保存時一定要避免與揮發(fā)性有機溶劑同放一室，以免降低抗體的效價。
⑥檢查標本的儲存條件，好用已知陽性的標本來同時做陽性對照。
⑦檢查色原/底物溶液，簡單的檢測方法是將一滴標記有酶的抗體加入到制備好的底物溶液中，如果底物發(fā)生預期的顏色變化，則可排除底物的因素。需要注意的是，有些底物在制成工作液后應在一定時間內用完，否則會失效。
⑧檢查沖洗液是否和反應試劑匹配，溶液的pH值很重要，與過氧化物酶底物匹配的溶液中不應含有疊氮鈉。
⑨檢查復染劑和封片劑是否和所使用的色原匹配。
弱陽性
如果陰性對照沒有染色而陽性對照標本弱陽性，除了考慮上述因素外，還應考慮：
①標本的固定方式，不當?shù)墓潭ǚ绞交蚬潭〞r溫度過高，都會影響到所檢測的抗原的數(shù)量和質量。
②不適當?shù)目乖迯头绞剑捎谑炃衅谥谱鞯倪^程中固定劑對抗原的封閉作用，必須用抗原熱修復或酶消化或兩種同時使用的抗原雙暴露法，至于使用哪一種方法，應參照生產廠家的說明，同時結合標本的具體情況而定。
③抗體的稀釋度是否過高或者孵育的溫度/時間是否正確。一般試劑生產廠家都會對試劑給出一定的使用范圍，但是由于使用者的標本來自各種組織，處理過程也不盡相同，所以應參照使用范圍，對所使用的一抗進行梯度測試，找出佳的使用濃度。
④切片上遺留了過多的沖洗液，當抗體加至切片上時，等于人為地對抗體進行了進一步的稀釋。
⑤孵育時切片是否放置水平，否則會導致抗體流失。
如果陰性對照沒有反應，陽性對照反應良好，而標本弱陽性，則可能是由于陽性對照不是同一種組織、或固定方式不同等原因所致。
非特異性染色
①是否有效地去除了內源性酶和生物素。應注意的是，并不是每一種組織均需要進行此步驟，但對于內源性酶或生物素豐富的組織，如肝臟、腎臟等，需考慮此原因。處理的方法為：
滅活堿性磷酸酶：常用的方法是將左旋咪唑（24mg/m1）加入底物液中，并保持pH值在7.6~8.2，即能除去大部分內源性堿性磷酸酶，對于仍能干擾染色的酸性磷酸酶，可用50mmol/L的酒石酸抑制。
飽和處理內源性生物素：消除內源性生物素的方法是事先滴加親和素，以飽和內源性生物素，使之不再有剩余的結合位點。具體方法是在ABC法或SP法染色前將切片浸于25ug/ml親和素溶液中處理15分鐘，PBS清洗15分鐘后即可染色。
②是否選擇使用了正確的封閉血清。電荷吸附所造成的非特異性背景染色消除方法是以二抗動物的非免疫血清，用PBS稀釋為3%-10%溶液孵育切片，以封閉吸附位點。有時其它無關蛋白，如牛血清白蛋白也常應用。另外，取材時避開出血、壞死區(qū)亦極重要。近有些國內的實驗室應用5%脫脂奶粉替代血清進行抗原封閉，效果也不錯。
③所選擇的抗體是否符合試驗要求。因抗原不純、標本片中含有與靶抗原相似的抗原決定簇等原因造成的非特異性染色只能通過采用高純度、高效價的抗體、或針對具特異性抗原決定簇的單克隆抗體來解決。
④一抗的使用濃度是否過高。
⑤清洗是否充分。應嚴格操作規(guī)程。因在緩沖液中含有一定量的鹽，這亦有利于減低背景著色，通常0.05mol/l Tris—HCl，0.15mol/l NaCl已適用于多數(shù)染色方法，溶液內加入吐溫20，效果佳。特殊標記時，試劑公司一般都提供緩沖液的配方。
⑥ DBA的使用是否正確。DAB的孵育時間和配制方式可以產生某些背景顏色，使用濃縮型DAB試劑盒時，請嚴格按照說明書標明的滴加順序操作，注意校正蒸餾水的pH值，以確保實驗結果的正確性；粉劑DAB溶解時，常有一些不溶性顆粒，這些顆粒須經過濾除去，否則可能沉積于切片組織上，產生斑點狀著色。另外，DAB保存不妥產生氧化物亦可沉積于切片上，因此需將DAB保存于避光干燥處，現(xiàn)用現(xiàn)配，臨用前加H2O2。孵育時間過長也會造成背景染色。
⑦標本染色過程中是否曾經干涸，否則會造成邊緣部的非特異性染色。
⑧檢查二抗與標本的內源性組織蛋白是否有交叉反應。
對照/標本無染色
①確認是否忽略了應該加的某種試劑，包括一抗、二抗、三抗及底物等。
②確認所有的試劑是否按正確的順序加入，是否孵育了足夠的時間。
③對照抗體的標簽確認是否使用了正確的抗體，以及所用的檢測系統(tǒng)是否和一抗匹配，這一點是非常重要的。比如，如果一抗是兔來源的抗體，二抗一定要用抗兔的二抗來匹配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必須是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。
④檢查抗體所使用的稀釋度及稀釋溶液。
⑤檢查抗體的有效期和保存條件，尤其是標記了酶或熒光素的抗體，現(xiàn)在大多數(shù)試劑公司的抗體均要求在4~8℃條件下保存，應避免反復凍融，試劑保存時一定要避免與揮發(fā)性有機溶劑同放一室，以免降低抗體的效價。
⑥檢查標本的儲存條件，好用已知陽性的標本來同時做陽性對照。
⑦檢查色原/底物溶液，簡單的檢測方法是將一滴標記有酶的抗體加入到制備好的底物溶液中，如果底物發(fā)生預期的顏色變化，則可排除底物的因素。需要注意的是，有些底物在制成工作液后應在一定時間內用完，否則會失效。
⑧檢查沖洗液是否和反應試劑匹配，溶液的pH值很重要，與過氧化物酶底物匹配的溶液中不應含有疊氮鈉。
⑨檢查復染劑和封片劑是否和所使用的色原匹配。
弱陽性
如果陰性對照沒有染色而陽性對照標本弱陽性，除了考慮上述因素外，還應考慮：
①標本的固定方式，不當?shù)墓潭ǚ绞交蚬潭〞r溫度過高，都會影響到所檢測的抗原的數(shù)量和質量。
②不適當?shù)目乖迯头绞剑捎谑炃衅谥谱鞯倪^程中固定劑對抗原的封閉作用，必須用抗原熱修復或酶消化或兩種同時使用的抗原雙暴露法，至于使用哪一種方法，應參照生產廠家的說明，同時結合標本的具體情況而定。
③抗體的稀釋度是否過高或者孵育的溫度/時間是否正確。一般試劑生產廠家都會對試劑給出一定的使用范圍，但是由于使用者的標本來自各種組織，處理過程也不盡相同，所以應參照使用范圍，對所使用的一抗進行梯度測試，找出佳的使用濃度。
④切片上遺留了過多的沖洗液，當抗體加至切片上時，等于人為地對抗體進行了進一步的稀釋。
⑤孵育時切片是否放置水平，否則會導致抗體流失。
如果陰性對照沒有反應，陽性對照反應良好，而標本弱陽性，則可能是由于陽性對照不是同一種組織、或固定方式不同等原因所致。
非特異性染色
①是否有效地去除了內源性酶和生物素。應注意的是，并不是每一種組織均需要進行此步驟，但對于內源性酶或生物素豐富的組織，如肝臟、腎臟等，需考慮此原因。處理的方法為：
滅活堿性磷酸酶：常用的方法是將左旋咪唑（24mg/m1）加入底物液中，并保持pH值在7.6~8.2，即能除去大部分內源性堿性磷酸酶，對于仍能干擾染色的酸性磷酸酶，可用50mmol/L的酒石酸抑制。
飽和處理內源性生物素：消除內源性生物素的方法是事先滴加親和素，以飽和內源性生物素，使之不再有剩余的結合位點。具體方法是在ABC法或SP法染色前將切片浸于25ug/ml親和素溶液中處理15分鐘，PBS清洗15分鐘后即可染色。
②是否選擇使用了正確的封閉血清。電荷吸附所造成的非特異性背景染色消除方法是以二抗動物的非免疫血清，用PBS稀釋為3%-10%溶液孵育切片，以封閉吸附位點。有時其它無關蛋白，如牛血清白蛋白也常應用。另外，取材時避開出血、壞死區(qū)亦極重要。近有些國內的實驗室應用5%脫脂奶粉替代血清進行抗原封閉，效果也不錯。
③所選擇的抗體是否符合試驗要求。因抗原不純、標本片中含有與靶抗原相似的抗原決定簇等原因造成的非特異性染色只能通過采用高純度、高效價的抗體、或針對具特異性抗原決定簇的單克隆抗體來解決。
④一抗的使用濃度是否過高。
⑤清洗是否充分。應嚴格操作規(guī)程。因在緩沖液中含有一定量的鹽，這亦有利于減低背景著色，通常0.05mol/l Tris—HCl，0.15mol/l NaCl已適用于多數(shù)染色方法，溶液內加入吐溫20，效果佳。特殊標記時，試劑公司一般都提供緩沖液的配方。
⑥ DBA的使用是否正確。DAB的孵育時間和配制方式可以產生某些背景顏色，使用濃縮型DAB試劑盒時，請嚴格按照說明書標明的滴加順序操作，注意校正蒸餾水的pH值，以確保實驗結果的正確性；粉劑DAB溶解時，常有一些不溶性顆粒，這些顆粒須經過濾除去，否則可能沉積于切片組織上，產生斑點狀著色。另外，DAB保存不妥產生氧化物亦可沉積于切片上，因此需將DAB保存于避光干燥處，現(xiàn)用現(xiàn)配，臨用前加H2O2。孵育時間過長也會造成背景染色。
⑦標本染色過程中是否曾經干涸，否則會造成邊緣部的非特異性染色。
⑧檢查二抗與標本的內源性組織蛋白是否有交叉反應。
