關于免疫熒光染色和注意事項介紹
免疫學的基本反應是抗原-抗體反應。由于抗原抗體反應具有高度的特異性，所以當抗原抗體發生反應時，只要知道其中的一個因素，就可以查出另一個因素。免疫熒光技術就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體（或抗原）上，與其相應的抗原（或抗體）結合后，在熒光顯微鏡下呈現一種特異性熒光反應。
免疫熒光染色
(1）冰凍切片用0.01moULPBST（或PBS）漂洗或沖洗3次，每次5min。
(2)3%H2O2孵育10min，再用0.01mol/LPBS沖洗3次，每次5min。
(3)5％一8％的正常動物血清（山羊或馬血清）孵育30-60min。
(4）洗掉血清，滴加一抗（0.01mol/LPBS配制），4℃過夜。
(5）吸出一抗，0.01mol/LPBS沖洗3次，每次5min，加入熒光標記的二抗（0.01mol/LPBS配制），4℃過夜。
(6）吸出二抗，0.01mol/LPBS沖洗3次，每次10min。
(7）封片劑封片，熒光顯微鏡觀察照相。典型的實驗結果見圖20.2B。
注意事項：
(1)由于熒光容易淬滅，一般僅能維持幾個小時，因此，熒光二抗應避光保存，即從加入熒光二抗以后的步驟中都要盡量避光操作。封片后應盡早照相，目前有市售的熒光增強劑，可使熒光在4℃保存1-2周仍不淬滅。
(2)常用的熒光素有以下幾種，綠色熒光：FITC、AlexaFluor488和GFP；紅色熒光：TRITC、Cy3、AlexaFluor568&594和MitoTrackerRed；藍色熒光：Hoechst、DAPI；黃色熒光：YFP、Fluo-3和Rhoda-minel23等。
(3）不同的熒光素激發的波長不同，因此，選用濾光片時要注意。一般紫外線的激發波長為334-365nm，藍光的激發波長為435-490nm，綠光的激發波長為546nm左右。
(4)熒光顯微鏡應提前至少15min打開汞燈預熱。關閉30min后方可再開啟。
(5）免疫熒光的組織要求很高，載玻片及蓋玻片要干凈無雜質。進行熒光染色時，需注意染液的pH、濃度和染色溫度，還要避免對熒光有熄滅作用的物質的接觸。組織和細胞也有自發熒光，如紅細胞中的血紅蛋白呈紅色熒光，維生素A呈綠色自發性熒光等。
免疫熒光染色
(1）冰凍切片用0.01moULPBST（或PBS）漂洗或沖洗3次，每次5min。
(2)3%H2O2孵育10min，再用0.01mol/LPBS沖洗3次，每次5min。
(3)5％一8％的正常動物血清（山羊或馬血清）孵育30-60min。
(4）洗掉血清，滴加一抗（0.01mol/LPBS配制），4℃過夜。
(5）吸出一抗，0.01mol/LPBS沖洗3次，每次5min，加入熒光標記的二抗（0.01mol/LPBS配制），4℃過夜。
(6）吸出二抗，0.01mol/LPBS沖洗3次，每次10min。
(7）封片劑封片，熒光顯微鏡觀察照相。典型的實驗結果見圖20.2B。
注意事項：
(1)由于熒光容易淬滅，一般僅能維持幾個小時，因此，熒光二抗應避光保存，即從加入熒光二抗以后的步驟中都要盡量避光操作。封片后應盡早照相，目前有市售的熒光增強劑，可使熒光在4℃保存1-2周仍不淬滅。
(2)常用的熒光素有以下幾種，綠色熒光：FITC、AlexaFluor488和GFP；紅色熒光：TRITC、Cy3、AlexaFluor568&594和MitoTrackerRed；藍色熒光：Hoechst、DAPI；黃色熒光：YFP、Fluo-3和Rhoda-minel23等。
(3）不同的熒光素激發的波長不同，因此，選用濾光片時要注意。一般紫外線的激發波長為334-365nm，藍光的激發波長為435-490nm，綠光的激發波長為546nm左右。
(4)熒光顯微鏡應提前至少15min打開汞燈預熱。關閉30min后方可再開啟。
(5）免疫熒光的組織要求很高，載玻片及蓋玻片要干凈無雜質。進行熒光染色時，需注意染液的pH、濃度和染色溫度，還要避免對熒光有熄滅作用的物質的接觸。組織和細胞也有自發熒光，如紅細胞中的血紅蛋白呈紅色熒光，維生素A呈綠色自發性熒光等。
