改良Lowry法蛋白定量試劑盒技術原理
關鍵詞：蛋白定量試劑盒 標準品 96微孔板 古朵生物
改良Lowry法蛋白定量試劑盒 規格：500T/1000T
分類：蛋白檢測
儲存條件：室溫,避光，12個月
用途：微板法,改良Lowry法定量檢測蛋白濃度
注意事項：利用蛋白中肽鍵與銅離子結合成四配位基銅離子復合物,后者與Folin試劑(福林酚)反應,產生藍色比色物,用分光光度法(酶標儀或分光光度計)檢測750nm處吸光度
簡介：
目前世界上常用的蛋白濃度檢測方法是：BCA蛋白定量試劑盒(BCA Protein Assay Kit)和Bradford蛋白定量試劑盒(Bradford Protein Assay Kit)。改良Lowry法蛋白定量試劑盒是利用蛋白中肽鍵與銅離子結合成四配位基銅離子復合物，后者與Folin試劑(福林酚)反應，產生藍色比色物，用分光光度法(酶標儀或分光光度計)檢測750nm處吸光度，并與標準曲線比較，求得待測蛋白樣品的濃度。在1~1500ug/ml濃度范圍內有較好的線性關系。
操作步驟：
一、準備工作
1.制備溶液A：將16mL溶液A成分二和16mL溶液A成分三加入到裝溶液A成分一的塑料瓶中，混合均勻得到240mL溶液A。注意：溶液A各成分分開提供加穩定。
2.制備Lowry工作液：將溶液A、溶液B和溶液C按3：1：1的體積比混合得到Lowry工作液。此工作液可以室溫放置2-3周，所以好用多少配多少。如果發現溶液B或溶液C有沉淀，需37℃溶解并搖勻后再使用。
3.制備福林酚工作液：在裝有10mL福林酚的棕色塑料瓶中加入90mL去離子水，搖晃混勻待用。此工作液在避光條件下可以放置6個月。
二、試管法
4.先用去離子水將BSA標準(2mg/mL)稀釋到50μg/mL，然后在標記的試管中加入下列成分(單位：μL)。注意：每個樣品好做三個稀釋度，每個稀釋度好設置三次重復，陰性對照和標準品也好做三次重復。
5.每管中加入200μl Lowry工作液，振蕩混勻后室溫反應10分鐘。
6.每管中加入100μl福林酚工作液，振蕩混勻后室溫反應30分鐘。
7.用容量為0.5mL、光徑為1cm的玻璃比色杯或聚苯乙烯比色杯測定750nm的光吸收。測定時，先空白(即陰性對照)后樣品，測定樣品和BSA標準品時，先低濃度后高濃度。測定未知樣品前需要將杯子清洗干凈，必要時可以用甲醇清洗吸附到比色杯壁上的染料。
8.根據標準品三個重復的平均值繪制標準曲線，然后根據未知樣品的光吸收從標準曲線中查得其對應的濃度。
三、96微孔板法
9.同上，只是反應用96微孔板設置，用酶標測試儀750nm測定光吸收。
四、樣品中干擾物質的去除(本產品不含相關產品，如果樣品中有干擾Lowry法蛋白定量的物質，可另購本公司的微量蛋白質沉淀試劑盒去除，也可以用自備試劑按下法去除：用水將樣品調到體積為200μl，加入20μl 0.15%去氧膽酸鈉，混勻，室溫放置10分鐘。加入20μL 72%的TCA，室溫放置5分鐘。3000g離心15分鐘，小心去除上清。用200μl水溶解蛋白沉淀后以用于Lowry法測定。
附：常見Lowry法蛋白定量干擾物(低于所列濃度不干擾，高于所列濃度則會干擾，需要按上法去除。不能含任何濃度的DTE，DTT和硫酸胺)。
疑難解答：
1.該方法檢測的蛋白質濃度范圍1μg～50μg/ml。
2.由于Lowry法測定的是蛋白質中酪氨酸殘基，對于那些酪氨酸殘基數高于或低于BSA，其測定的蛋白質含量將偏低或偏高。如果遇到該情況，需要采用BCA或Bradford法測定。
3.閱讀測定方法后化學試劑對測定方法的影響。
