標簽：超氧化物歧化酶 古朵生物 ELISA試劑盒

  古朵生物| 超氧化物歧化酶試劑盒說明書(NBT法)

  正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

  測定意義：

  SOD(EC 1.15.1.1)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，催化超氧化物陰離子發生岐化作用，生成H2O2和O2。SOD不僅是超氧化物陰離子清除酶，也是H2O2主要生成酶，在生物抗氧化系統中具有重要作用。

  測定原理：

  通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統產生超氧陰離子(O2-.)，O2-.可還原氮藍四唑生成藍色甲臜，后者在560nm處有吸收;SOD可清除O2-.，從而抑制了甲臜的形成;反應液藍色越深，說明SOD活性愈低，反之活性越高。

  超氧化物歧化酶試劑盒組成：

  產品名稱SR002-100T/96SStorage

  提取液：液體100ml4℃

  試劑一：液體5ml4℃

  試劑二：液體200μl4℃

  試劑三：液體4ml4℃

  試劑四：粉劑2瓶4℃

  說明書一份

  自備儀器和用品：

  酶標儀、離心機、移液器、96孔板、研缽、冰和蒸餾水

  粗酶液提取：

  1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

  細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104個)：提取液體積(ml)為500~1000：1的比例(建議500 萬細菌或細胞加入1ml提取液)，超聲波破碎細菌或細胞(冰浴，功率20%或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次);8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

  組織：按照組織質量(g)：提取液體積(ml)為1：5~10的比例(建議稱取約0.1g組織，加入1ml提取液)，進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

  2、血清(漿)樣品：直接檢測。

  測定步驟：

  1、 酶標儀預熱30min以上，調節波長至560nm。

  2、 將試劑二用蒸餾水稀釋兩倍，用多少配多少。(試劑二和蒸餾水1：1稀釋)

  3、 將一瓶試劑四用5ml蒸餾水溶解(溶解后一周內用完)，再用蒸餾水稀釋4倍，用多少配多少(試劑四和蒸餾水1：3稀釋)。

  4、 測定前將試劑一、三和四在37℃(哺乳動物)或25℃(其他物種)水浴5min以上。

  5、 樣本測定(在EP管或96孔板中依次加入下列試劑)

  試劑名稱(μl)測定管對照管

  試劑一4545

  試劑二22

  樣本 18

  蒸餾水

  18

  試劑三3535

  試劑四100100

  充分混勻，室溫靜置30min后，560nm處測定各管吸光值A。

  超氧化物歧化酶試劑盒注意事項：

  1、試劑二為酶，不可冷凍，使用時在冰上放置。

  2、對照管只需要做一管。

  3、若對照管吸光值大于1，建議將試劑二用蒸餾水稀釋7倍后使用(10μl試劑二原液+60μl蒸餾水)。

  4、SOD為什么有的樣本測定管大于對照管，對照管數值在什么范圍?

  對照管的范圍是0.4-1。對照管吸光值過低可能是(1)試劑二或試劑四沒有現配現用;(2)沒有按順序加試劑;(3)反應時間不夠，可以延長反應時間(反應時間30min可以延長到40min)。對照管吸光值過高可能是試劑二未按操作說明書稀釋相應倍數。

  若出現測定管大于對照管，可能是樣本中雜質的影響太大，為了降低雜質的影響一般將樣本提取上清液用蒸餾水或提取液稀釋10倍后再測，通常可以使測定正常。計算公式中乘以相應稀釋倍數。

  SOD活性計算：

  抑制百分率的計算

  抑制百分率=(A對照管-A測定管) ÷A對照管×

  盡量使樣本的抑制百分率在10-90%范圍內。如果計算出來的抑制百分率小于10%或大于90%，則通常需要調整加樣量后重新測定。如果測定出來的抑制百分率偏高，則需將樣本用提取液適當稀釋;如果測定出來的抑制百分率偏低，則需重新準備濃度比較高的待測樣本。

  2、SOD酶活性單位：在上述黃嘌呤氧化酶藕聯反應體系中抑制百分率為50%時，反應體系中的SOD酶活力定義為一個酶活力單位(U/ml)。

  3、SOD酶活性計算：

  (1)血清(漿)SOD活性(U/ml)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反總]÷V樣=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率)

  (2)組織、細菌或培養細胞SOD活力計算：

  a.按樣本蛋白濃度計算

  SOD活性(U/mg prot)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反總]÷(V樣×Cpr) =11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率)÷Cpr需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒。

  b.按樣本鮮重計算

  SOD活性(U/g 鮮重)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反總]÷(W ×V樣÷V樣總)=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率)÷W

  c.按細菌或細胞個數計算

  SOD活力(U/104 cell)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率) ×V反總]÷(500×V樣÷V樣總)=0.022×抑制百分率÷(1-抑制百分率)

  V反總：反應體系總體積，0.2ml;V樣：加入反應體系中樣本體積，0.018ml;V樣總：加入提取液體積，1 ml;Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/ml ;W：樣本質量，g;500：細胞或細菌總數，500萬。

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