古朵快訊：ELISA中非特異性顯色原因分析

  影響ELISA中非特異性顯色的原因很多，如試劑盒特異性、檢驗標本中含酶標記物的干擾物，操作過程中的問題。本文就這一原因作一簡要分析,以便可以通過以上措施把非特異顯色降至zui低限度，從而提高檢測的特異性，并得到準確、可靠的實驗結果。

  【關鍵詞】 ELISA 非特異性 顯色

  酶聯免疫吸附試驗(ELISA)自1971年自問世以來，以其敏感性高，特異性強，操作簡便、安全，而廣泛應用于臨床診斷，開創了免疫學診斷的新紀元。但同其它免疫診斷方法一樣酶免試劑在它的研究、生產及使用中常常會碰到非特異性問題，本文就在實驗過程中產生的一些原因及如何采取一些措施，消除非特異性顯色作一分析。

  1、試劑盒特異性因素

  1、1 固相載體的選擇。ELISA中常用的固相載體有微量滴定板、小珠和小試管三種，以微量滴定板zui為常見[1]。它具有良好的吸附性能，孔底透明度高，空白值低，各板之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別，各產品的質量差異很大。因此，在選擇試劑盒同時要對其使用的微孔板型號進行認證，評估。

  1、2包被物的純度。在酶聯免疫測定尤其是間接ELISA中，試劑的特異性取決于使用抗原的純度。目前由于技術條件的限制，包被用抗原或抗體的純度不可能達到，所以有些非特異性顯色不可避免，只能盡可能提高純度，提高特異性。目前使用的包被抗原一般為合成多肽抗原。

  1、3包被抗體的效價。具有高親和力和高特異性的包被抗體，是決定試劑特異性的重要方面。

  1、4 封閉。是ELISA中重要的一步，目的是封閉固相載體表面尚未被所占據的空隙[2]，減少后續步驟中非特異性蛋白的干擾。

  2、檢驗標本中含有酶標記物的干擾物

  2、1內源性干擾物：類風濕因子(RF)、黃疸等，類風濕因子是可作用于多種動物以及人IgGFc段的自身抗體，多數為IgM類，能充當抗原成分與固相及酶標抗體反應，從而呈現非特異性顯色。

  黃疸血標本中常含有內源性過氧化物酶，如用辣根過氧化物酶為標記物，就有可能產生非特異性顯色。

  2、2 外源性干擾物，常常因樣品采集、貯存、處理不當造成如樣品溶血，被細菌污染，標本凝集不全等。溶血標本，紅細胞溶解破裂，釋放出血紅素形成，而血紅素中的鐵卟啉是過氧化物酶的類似物，以HRP為標記的ELISA測定中，溶血標本可能會增加非特異性顯色。如有細菌污染，菌體中可能含有內源性HRP(辣根過氧化酶)[2]，有國內報道酶免HBsAg試劑檢測溶血標本時可造成假陽性[3]。如在冰箱中保存過久，其中的IgG可發生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深[2]。因此，血標本在采集處理時應小心，在冰箱中保存不易過久。

  標本凝集不全時，血清中會殘留部分纖維蛋白原，也易造成假陽性。

  3、操作過程中的問題造成假陽性

  3、1加樣

  對于間接ELISA標本一般都要進行稀釋，如果加樣不準就會造成誤差，尤其當稀釋倍數大時，很小的誤差，會導致較大的相對誤差，使陰性(或弱陽性)標本呈陽性(或陰性)。加樣時應將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產生氣泡。目前，大部分血站都已使用全自動酶免加樣系統處理標本，可較好地避免以上誤差。

  3、2洗滌

  在ELISA中正確的洗滌是保證得到可重復結果的關健一步，應引起操作者重視。無論是手工操作還是機器操作，得出不正確的結果常與不正確的洗滌有關，ELISA就是靠洗滌來達到分離游離和結合的酶標記物的目的。通過洗滌以消除殘留在板孔中沒能與固體抗原或抗體結合的物質，以及在反應過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質。

  3、3 溫育

  每種試劑都有其*反應模式，其中溫度和溫育時間控制是重要因素。因孵育溫度高，反應時間長，會造成整板本底高，陽性率高。溫育一般用濕盒或水浴，反應板不宜疊放，以保證各板溫度都能迅速平衡，為避免蒸發，板上應加蓋。

  3、4酶標儀判讀

  作為記錄測定結果的儀器，酶標儀的性能穩定與否，決定結果的可靠度。首先酶標儀應定期進行保養，對濾光片要定期校正;其次酶標儀波長設置要正確，使用雙波長，一個檢測波長，一個參比波長，以消除微孔板底部劃痕、不平、指印或液面高度差異造成的光干擾。此外，在用酶標儀讀數時先擦試微孔板底部并壓平板條。由于各種酶標儀性能有所不同，使用中應詳細閱讀說明書

  綜上所述，由于酶聯免疫吸附技術目前在技術上缺乏標準化，盡管目前上以及我國有了部分標準血清或參比血清(血清盤)。但由于受方法學及技術條件的限制，在酶聯吸附測定中有時不可避免的會出現一定的非特異性，但我們可以通過以上措施把非特異性顯色降至zui低限底，從而提高檢測的特異性，并得到準確、可靠的實驗結果

  ELISA上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區。是一家專門從事生物技術相關產品，勵志研發和銷售的綜合性生物公司，產品遠銷多個國家和地區，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準則、以市場需求為導向，不斷開發高質量的新產品，提供客戶滿意的綜合服務質量"的方針。