古朵新聞：免疫沉淀技術的原理和抗體選擇
古朵新聞：免疫沉淀技術的原理和抗體選擇
隨著生物技術的發展，蛋白質與基因之間的互作逐漸成為科研人員的關注熱點，染色免疫沉淀技術由此而生，并被應用到各個科研領域當中。本文聚焦染色質免疫沉淀技術的原理、應用和抗體選擇等問題，讓您對其有全面的了解和認識。
隨著人類基因組測序工作的基本完成，功能基因組學的研究逐漸成為研究的熱點。而基因表達的調控又是功能基因組學的一個重要研究領域。
研究某個蛋白因子的調控功能，可以通過對蛋白活性(激活或抑制其活性)，蛋白數量(過表達Overex
然而這些方法都無法提供證據證明這些變化是受某個蛋白因子直接調節的，還是間接的其他變化導致的結果。所以，要想提供蛋白因子直接調控的證據，就要直接檢測蛋白質-DNA的相互作用。
傳統的方法包括轉錄因子結合實驗(Trans
染色質免疫沉淀技術(Chromatin Immunoprecipitation，簡稱ChIP)是研究體內蛋白質與DNA相互作用的一種技術。它利用抗原抗體反應的特異性，可以真實地反映體內蛋白因子與基因組DNA結合的狀況。
特別是近年來由于該技術不斷的發展和完善，其應用范圍已經從研究目的蛋白與已知靶序列間的相互作用，發展到研究目的蛋白與整個基因組的未知序列的相互作用;從研究一個目的蛋白與DNA的相互作用，發展到研究兩個蛋白與DNA共同結合的相互作用;從研究啟動子區域的組蛋白的修飾，發展到研究結合在DNA序列上的蛋白復合物。隨著對基因功能研究的不斷深入，這項技術正越來越多的被應用于科研的各個領域。
ChIP技術的原理
染色質免疫沉淀技術的原理是：在生li狀態下把細胞內的DNA與蛋白質交聯在一起，通過超聲或酶處理將染色質切為小片段后，利用抗原抗體的特異性識別反應，將與目的蛋白相結合的DNA片段沉淀下來。染色質免疫沉淀技術一般包括細胞固定，染色質斷裂，染色質免疫沉淀，交聯反應的逆轉，DNA的純化，以及DNA的鑒定。
因為ChIP實驗涉及的步驟多，結果的重復性較低，所以對ChIP實驗過程的每一步都應設計相應的對照，而且對結果的分析也需要有一定的經驗。對于剛剛開始使用ChIP技術的研究人員來說，使用成熟的商品化試劑盒和相關的技術服務會達到事半功倍的效果，比如Millipore公司的EZ-ChIP試劑盒就是專門為初學者設計的入門產品。下面我們就zui基本的實驗步驟，實驗中的小技巧以及需要注意的問題簡單介紹一下。
1.細胞固定
甲醛能有效的使蛋白質-蛋白質，蛋白質-DNA，蛋白質-RNA交聯，形成生物復合體，防止細胞內組分的重新分布。甲醛的交聯反應是*可逆的，便于在后續步驟中對DNA和蛋白質進行分析。交聯所用的甲醛終濃度為1%，交聯時間通常為5分鐘到1個小時，具體時間根據實驗而定。值得注意的是，交聯時間如果過長，細胞染色質難以用超聲波破碎，影響ChIP結果，而且實驗材料也容易在離心過程中丟失。交聯時間如果過短，則交聯不*，產生假陰性。甲醛的交聯反應可被加入的甘氨酸終止。
2.染色質斷裂
交聯后的染色質可被超聲波或Micrococcal Nuclease切成400~600 bp的片段(用瓊脂糖凝膠電泳檢測)，以便暴露目標蛋白，利于抗體識別。超聲波是使用機械力斷裂染色質，容易引起升溫或產生泡沫，這都會引起蛋白質變性，進而影響ChIP的效率。所以在超聲波斷裂染色質時，要在冰上進行，且要設計時斷時續的超聲程序，保證低溫。另外，超聲探頭要盡量深入管中，但不接觸管底或側壁，以免產生泡沫。
總超聲時間也不要太長，以免蛋白降解。Micrococcal Nuclease可以將染色質切成一到幾個核小體，比超聲波處理的結果精致，均一(圖1)。另外，酶反應的條件比較溫和，對DNA和DNA-蛋白復合物的損傷較小，而且蛋白不易變性。
酶處理染色質適用于新鮮的細胞或組織樣品和冰凍樣品。在研究組蛋白時，經常采用的研究方法。因為N-ChIP沒經過甲醛固定，超聲波處理會打斷組蛋白和DNA的結合，所以只能選擇酶處理染色質的方法。對于甲醛固定的樣品，一般選擇超聲波處理方法。也有研究人員使用酶處理的方法研究甲醛固定較溫和的樣品。Millipore公司有商品化的Micrococcal Nuclease處理的ChIP試劑盒(EZ-Enzyme)提供。
染色質免疫沉淀中的對照與抗體選擇
Input對照：
在進行免疫沉淀前，需要取一部分斷裂后的染色質做Input對照。Input是斷裂后的基因組DNA，需要與沉淀后的樣品DNA一起經過逆轉交聯，DNA純化，以及zui后的PCR或其他方法檢測。Input對照不僅可以驗證染色質斷裂的效果，還可以根據Input中的靶序列的含量以及染色質沉淀中的靶序列的含量，按照取樣比例換算出ChIP的效率，所以Input對照是ChIP實驗*的步驟。
Beads選擇：
接下來，利用目的蛋白質的特異抗體通過抗原-抗體反應形成DNA-蛋白質-抗體復合物，然后使用Agarose beads或Magna beads沉淀此復合物，特異性地富集與目的蛋白結合的DNA片段。再經過多次洗滌，除去非特異結合的染色質后，用SDS+NaHCO3洗脫免疫沉淀復合物。Magna beads是近年來出現的一種新型beads，它使用方便，不像Agarose beads那樣容易破裂，所以在操作過程中簡單，而且免去了離心的步驟，節省不少時間。
抗體選擇：
染色質免疫沉淀所選擇的目的蛋白的抗體是ChIP實驗成功的關鍵。因為在蛋白質與染色質交聯結合時，抗體的抗原表位可能因為與結合位點的距離太近，不能被抗體識別，所以不能有效地在體內形成免疫沉淀復合物，直接影響ChIP的結果。所以不是所有的抗體都能做ChIP實驗的，只有經過ChIP實驗驗證后的抗體才能確保實驗結果的可靠性。
陽性與陰性對照：
在做ChIP實驗時，一定要做好實驗對照，因為沒有對照，很難對實驗結果的可靠性進行評估。陽性抗體和陰性抗體對照是zui基本的實驗對照。陽性抗體通常選擇與已知序列相結合的比較保守的蛋白的抗體，常用的包括組蛋白抗體或RNA Polymerase II抗體等。
陰性抗體通常選擇目的蛋白抗體宿主的IgG或血清。目的蛋白抗體的結果與陽性抗體和陰性抗體的結果相比較，才能得出正確結論。另外，還應考慮目的蛋白抗體與DNA的非特異性結合的可能，所以通常還會選擇一對陰性引物，即目的蛋白肯定不會結合的DNA序列，作為該抗體的陰性對照。
*的陰性對照引物是在靶序列上游的一段與目的蛋白肯定不能結合的序列。如果目的蛋白沒有商品化的適用于染色質免疫沉淀實驗的抗體，只有其他用途的抗體時，可以先做蛋白質免疫沉淀(Immunoprecipitation)檢測。如果抗體可以成功的沉淀蛋白，再進行染色質免疫沉淀實驗的檢測。
交聯反應的逆轉和DNA的純化
用不含DNase的RNase和Proteinase K，65°C保溫6小時逆轉交聯，經DNA純化柱回收DNA或用酚lv仿抽提、乙醇沉淀純化DNA。DNA純化柱純化DNA的質量高，有利于下一步PCR等方法的檢測。因為甲醛不僅交聯DNA-蛋白質，還交聯蛋白質-蛋白質，所以還可以對DNA序列上的蛋白質復合物進行分析。在逆轉交聯時不使用Proteinase K，然后用丙酮回收有機相中的蛋白質，進行分析。
DNA的鑒定
zui常用的DNA的鑒定方法是半定量PCR和Real-time PCR。由于啟動子區域的序列具有多樣性的特點，所以不同的細胞系或不同的動物品系的同一基因的啟動子序列有可能不同。而且啟動子區域多富含CG的序列，其PCR條件可能需要相應調整。有條件可設計不止一對引物來反復驗證ChIP實驗的結果(圖2)。
ChIP技術的應用
染色質免疫沉淀的DNA適用于多種分析方法。如果目的蛋白的靶序列是已知的或需要驗證的，可采用狹縫雜交(Slot blot)的方法，把靶序列特異性探針與染色質免疫沉淀的DNA雜交，來驗證目的蛋白與DNA靶序列的特異性結合。還可以根據靶序列設計引物，用半定量PCR的方法進行測定，或采用Real-time PCR方法進行定量分析。如果目的蛋白的靶序列是未知的或高通量的(high-throughput)，可采用Southern雜交。
但因為免疫沉淀的DNA量較少，所以在研究時通常要用PCR方法擴增DNA探針，再進行整個基因組掃描。還可以把沉淀的DNA克隆到載體中，進行測序，尋找該序列附近的開放閱讀框，發現新的基因調節序列。
目前，隨著人類基因組測序工作的基本完成，研究目的蛋白和整個基因組的相互作用逐漸成為研究的熱點。由于基因組中的信息量非常大，上述常規方法通常無法滿足科研的需要。近年來發展起來的ChIP-chip技術將基因組DNA芯片(chip)技術與染色質免疫沉淀技術(ChIP)相結合，為研究目的蛋白與整個基因組相互作用提供了可能。
ChIP-chip技術通過標記染色質免疫沉淀富集的DNA片段，和另一個被標記不同探針的對照組樣品一起，與DNA芯片雜交，再利用各種生物信息學方法對收集到的信號進行分析，具體的實驗步驟請參考Dr.Richard Young在Nature Protocols上的文章。ChIP-chip技術已經被廣泛應用于研究轉錄因子在整個基因組中的信號網絡染色質修飾機制在基因組中的調控，DNA的復制，修復以及修飾，基因的轉錄與核運輸等諸多方面。
染色質免疫沉淀技術還可用于分析兩種蛋白共同結合的DNA序列，即ChIP reChIP方法。ChIP reChIP是在次ChIP的基礎上不解交聯，而繼續進行另一個目的蛋白的免疫沉淀，從而得到與兩種目的蛋白都結合的DNA序列。值得注意的是，因為通過兩次免疫沉淀富集的DNA量比較少，所以在分析時通常要把多次免疫沉淀的DNA濃縮后再進行操作。
近年來ChIP技術也被用于研究RNA-蛋白的相互作用，其原理與DNA類似，也包括甲醛固定，超聲波破細胞，免疫沉淀，交聯逆轉，RNA純化和RNA鑒定等步驟。所不同的是，交聯逆轉只用Proteinase K，要進行RNA純化和不含RNase的DNase處理，分析時用RT-PCR，芯片雜交要用cDNA芯片等。
隨著免疫沉淀技術的優點越來越廣受關注，如何改進染色免疫沉淀技術中的操作也越來越被科研人員所重視。
上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區。是一家專門從事生物技術相關產品，勵志研發和銷售的綜合性生物公司，產品遠銷多個國家和地區，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準則、以市場需求為導向，不斷開發高質量的新產品，提供客戶滿意的綜合服務質量"的方針
隨著生物技術的發展，蛋白質與基因之間的互作逐漸成為科研人員的關注熱點，染色免疫沉淀技術由此而生，并被應用到各個科研領域當中。本文聚焦染色質免疫沉淀技術的原理、應用和抗體選擇等問題，讓您對其有全面的了解和認識。
隨著人類基因組測序工作的基本完成，功能基因組學的研究逐漸成為研究的熱點。而基因表達的調控又是功能基因組學的一個重要研究領域。
研究某個蛋白因子的調控功能，可以通過對蛋白活性(激活或抑制其活性)，蛋白數量(過表達Overex
然而這些方法都無法提供證據證明這些變化是受某個蛋白因子直接調節的，還是間接的其他變化導致的結果。所以，要想提供蛋白因子直接調控的證據，就要直接檢測蛋白質-DNA的相互作用。
傳統的方法包括轉錄因子結合實驗(Trans
染色質免疫沉淀技術(Chromatin Immunoprecipitation，簡稱ChIP)是研究體內蛋白質與DNA相互作用的一種技術。它利用抗原抗體反應的特異性，可以真實地反映體內蛋白因子與基因組DNA結合的狀況。
特別是近年來由于該技術不斷的發展和完善，其應用范圍已經從研究目的蛋白與已知靶序列間的相互作用，發展到研究目的蛋白與整個基因組的未知序列的相互作用;從研究一個目的蛋白與DNA的相互作用，發展到研究兩個蛋白與DNA共同結合的相互作用;從研究啟動子區域的組蛋白的修飾，發展到研究結合在DNA序列上的蛋白復合物。隨著對基因功能研究的不斷深入，這項技術正越來越多的被應用于科研的各個領域。
ChIP技術的原理
染色質免疫沉淀技術的原理是：在生li狀態下把細胞內的DNA與蛋白質交聯在一起，通過超聲或酶處理將染色質切為小片段后，利用抗原抗體的特異性識別反應，將與目的蛋白相結合的DNA片段沉淀下來。染色質免疫沉淀技術一般包括細胞固定，染色質斷裂，染色質免疫沉淀，交聯反應的逆轉，DNA的純化，以及DNA的鑒定。
因為ChIP實驗涉及的步驟多，結果的重復性較低，所以對ChIP實驗過程的每一步都應設計相應的對照，而且對結果的分析也需要有一定的經驗。對于剛剛開始使用ChIP技術的研究人員來說，使用成熟的商品化試劑盒和相關的技術服務會達到事半功倍的效果，比如Millipore公司的EZ-ChIP試劑盒就是專門為初學者設計的入門產品。下面我們就zui基本的實驗步驟，實驗中的小技巧以及需要注意的問題簡單介紹一下。
1.細胞固定
甲醛能有效的使蛋白質-蛋白質，蛋白質-DNA，蛋白質-RNA交聯，形成生物復合體，防止細胞內組分的重新分布。甲醛的交聯反應是*可逆的，便于在后續步驟中對DNA和蛋白質進行分析。交聯所用的甲醛終濃度為1%，交聯時間通常為5分鐘到1個小時，具體時間根據實驗而定。值得注意的是，交聯時間如果過長，細胞染色質難以用超聲波破碎，影響ChIP結果，而且實驗材料也容易在離心過程中丟失。交聯時間如果過短，則交聯不*，產生假陰性。甲醛的交聯反應可被加入的甘氨酸終止。
2.染色質斷裂
交聯后的染色質可被超聲波或Micrococcal Nuclease切成400~600 bp的片段(用瓊脂糖凝膠電泳檢測)，以便暴露目標蛋白，利于抗體識別。超聲波是使用機械力斷裂染色質，容易引起升溫或產生泡沫，這都會引起蛋白質變性，進而影響ChIP的效率。所以在超聲波斷裂染色質時，要在冰上進行，且要設計時斷時續的超聲程序，保證低溫。另外，超聲探頭要盡量深入管中，但不接觸管底或側壁，以免產生泡沫。
總超聲時間也不要太長，以免蛋白降解。Micrococcal Nuclease可以將染色質切成一到幾個核小體，比超聲波處理的結果精致，均一(圖1)。另外，酶反應的條件比較溫和，對DNA和DNA-蛋白復合物的損傷較小，而且蛋白不易變性。
酶處理染色質適用于新鮮的細胞或組織樣品和冰凍樣品。在研究組蛋白時，經常采用的研究方法。因為N-ChIP沒經過甲醛固定，超聲波處理會打斷組蛋白和DNA的結合，所以只能選擇酶處理染色質的方法。對于甲醛固定的樣品，一般選擇超聲波處理方法。也有研究人員使用酶處理的方法研究甲醛固定較溫和的樣品。Millipore公司有商品化的Micrococcal Nuclease處理的ChIP試劑盒(EZ-Enzyme)提供。
染色質免疫沉淀中的對照與抗體選擇
Input對照：
在進行免疫沉淀前，需要取一部分斷裂后的染色質做Input對照。Input是斷裂后的基因組DNA，需要與沉淀后的樣品DNA一起經過逆轉交聯，DNA純化，以及zui后的PCR或其他方法檢測。Input對照不僅可以驗證染色質斷裂的效果，還可以根據Input中的靶序列的含量以及染色質沉淀中的靶序列的含量，按照取樣比例換算出ChIP的效率，所以Input對照是ChIP實驗*的步驟。
Beads選擇：
接下來，利用目的蛋白質的特異抗體通過抗原-抗體反應形成DNA-蛋白質-抗體復合物，然后使用Agarose beads或Magna beads沉淀此復合物，特異性地富集與目的蛋白結合的DNA片段。再經過多次洗滌，除去非特異結合的染色質后，用SDS+NaHCO3洗脫免疫沉淀復合物。Magna beads是近年來出現的一種新型beads，它使用方便，不像Agarose beads那樣容易破裂，所以在操作過程中簡單，而且免去了離心的步驟，節省不少時間。
抗體選擇：
染色質免疫沉淀所選擇的目的蛋白的抗體是ChIP實驗成功的關鍵。因為在蛋白質與染色質交聯結合時，抗體的抗原表位可能因為與結合位點的距離太近，不能被抗體識別，所以不能有效地在體內形成免疫沉淀復合物，直接影響ChIP的結果。所以不是所有的抗體都能做ChIP實驗的，只有經過ChIP實驗驗證后的抗體才能確保實驗結果的可靠性。
陽性與陰性對照：
在做ChIP實驗時，一定要做好實驗對照，因為沒有對照，很難對實驗結果的可靠性進行評估。陽性抗體和陰性抗體對照是zui基本的實驗對照。陽性抗體通常選擇與已知序列相結合的比較保守的蛋白的抗體，常用的包括組蛋白抗體或RNA Polymerase II抗體等。
陰性抗體通常選擇目的蛋白抗體宿主的IgG或血清。目的蛋白抗體的結果與陽性抗體和陰性抗體的結果相比較，才能得出正確結論。另外，還應考慮目的蛋白抗體與DNA的非特異性結合的可能，所以通常還會選擇一對陰性引物，即目的蛋白肯定不會結合的DNA序列，作為該抗體的陰性對照。
*的陰性對照引物是在靶序列上游的一段與目的蛋白肯定不能結合的序列。如果目的蛋白沒有商品化的適用于染色質免疫沉淀實驗的抗體，只有其他用途的抗體時，可以先做蛋白質免疫沉淀(Immunoprecipitation)檢測。如果抗體可以成功的沉淀蛋白，再進行染色質免疫沉淀實驗的檢測。
交聯反應的逆轉和DNA的純化
用不含DNase的RNase和Proteinase K，65°C保溫6小時逆轉交聯，經DNA純化柱回收DNA或用酚lv仿抽提、乙醇沉淀純化DNA。DNA純化柱純化DNA的質量高，有利于下一步PCR等方法的檢測。因為甲醛不僅交聯DNA-蛋白質，還交聯蛋白質-蛋白質，所以還可以對DNA序列上的蛋白質復合物進行分析。在逆轉交聯時不使用Proteinase K，然后用丙酮回收有機相中的蛋白質，進行分析。
DNA的鑒定
zui常用的DNA的鑒定方法是半定量PCR和Real-time PCR。由于啟動子區域的序列具有多樣性的特點，所以不同的細胞系或不同的動物品系的同一基因的啟動子序列有可能不同。而且啟動子區域多富含CG的序列，其PCR條件可能需要相應調整。有條件可設計不止一對引物來反復驗證ChIP實驗的結果(圖2)。
ChIP技術的應用
染色質免疫沉淀的DNA適用于多種分析方法。如果目的蛋白的靶序列是已知的或需要驗證的，可采用狹縫雜交(Slot blot)的方法，把靶序列特異性探針與染色質免疫沉淀的DNA雜交，來驗證目的蛋白與DNA靶序列的特異性結合。還可以根據靶序列設計引物，用半定量PCR的方法進行測定，或采用Real-time PCR方法進行定量分析。如果目的蛋白的靶序列是未知的或高通量的(high-throughput)，可采用Southern雜交。
但因為免疫沉淀的DNA量較少，所以在研究時通常要用PCR方法擴增DNA探針，再進行整個基因組掃描。還可以把沉淀的DNA克隆到載體中，進行測序，尋找該序列附近的開放閱讀框，發現新的基因調節序列。
目前，隨著人類基因組測序工作的基本完成，研究目的蛋白和整個基因組的相互作用逐漸成為研究的熱點。由于基因組中的信息量非常大，上述常規方法通常無法滿足科研的需要。近年來發展起來的ChIP-chip技術將基因組DNA芯片(chip)技術與染色質免疫沉淀技術(ChIP)相結合，為研究目的蛋白與整個基因組相互作用提供了可能。
ChIP-chip技術通過標記染色質免疫沉淀富集的DNA片段，和另一個被標記不同探針的對照組樣品一起，與DNA芯片雜交，再利用各種生物信息學方法對收集到的信號進行分析，具體的實驗步驟請參考Dr.Richard Young在Nature Protocols上的文章。ChIP-chip技術已經被廣泛應用于研究轉錄因子在整個基因組中的信號網絡染色質修飾機制在基因組中的調控，DNA的復制，修復以及修飾，基因的轉錄與核運輸等諸多方面。
染色質免疫沉淀技術還可用于分析兩種蛋白共同結合的DNA序列，即ChIP reChIP方法。ChIP reChIP是在次ChIP的基礎上不解交聯，而繼續進行另一個目的蛋白的免疫沉淀，從而得到與兩種目的蛋白都結合的DNA序列。值得注意的是，因為通過兩次免疫沉淀富集的DNA量比較少，所以在分析時通常要把多次免疫沉淀的DNA濃縮后再進行操作。
近年來ChIP技術也被用于研究RNA-蛋白的相互作用，其原理與DNA類似，也包括甲醛固定，超聲波破細胞，免疫沉淀，交聯逆轉，RNA純化和RNA鑒定等步驟。所不同的是，交聯逆轉只用Proteinase K，要進行RNA純化和不含RNase的DNase處理，分析時用RT-PCR，芯片雜交要用cDNA芯片等。
隨著免疫沉淀技術的優點越來越廣受關注，如何改進染色免疫沉淀技術中的操作也越來越被科研人員所重視。
上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區。是一家專門從事生物技術相關產品，勵志研發和銷售的綜合性生物公司，產品遠銷多個國家和地區，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準則、以市場需求為導向，不斷開發高質量的新產品，提供客戶滿意的綜合服務質量"的方針
