人β神經(jīng)生長因子(NGF-β)酶聯(lián)免疫試劑盒技術(shù)資料

  包裝描述：

  試劑名稱數(shù)量試劑名稱數(shù)量

  96孔板(預(yù)包被)196孔板覆膜2

  標(biāo)準(zhǔn)品2標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1×20mL

  檢測(cè)溶液A1×120μL檢測(cè)稀釋液A1×12mL

  檢測(cè)溶液B1×120μL檢測(cè)稀釋液B1×12mL

  TMB底物1×9mL終止液1×6mL

  濃洗滌液(30×)1×20mL說明書1

  測(cè)定步驟總結(jié)

  1.準(zhǔn)備所有試劑，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品;

  2.向每個(gè)孔中添加100μL標(biāo)準(zhǔn)液或樣品。在37℃下孵育2小時(shí);

  3.吸出并加入100μL準(zhǔn)備好的檢測(cè)試劑A。在37℃孵育1小時(shí);

  4.吸凈并清洗3次;

  5.加入100μL制備的檢測(cè)試劑B。在37℃孵育1小時(shí);

  6.吸氣并清洗5次;

  7.添加90μL底物溶液。在37℃下孵育15-25分鐘;

  8.添加50μL終止液。立即在450nm處讀取。

  需自備的設(shè)備及試劑

  450±10nm濾光片的酶標(biāo)儀(建議儀器使用前提前預(yù)熱)

  單道或多道微量加液器及吸頭

  稀釋樣品的EP管

  蒸餾水或去離子水

  吸水紙

  盛放洗液的容器

  試劑盒的儲(chǔ)存及有效期

  未開封的試劑盒：所有試劑均按試劑瓶標(biāo)簽上所示保存。請(qǐng)注意，收到試劑盒后請(qǐng)盡快將TMB 洗滌液，終止液保存于4℃，其他試劑保存于-20℃。

  使用后的試劑盒：剩余試劑仍需按照試劑瓶標(biāo)簽所示的溫度保存，開封后的酶標(biāo)板要加干燥劑后密封保存于-20℃，避免潮濕。

  穩(wěn)定性

  經(jīng)測(cè)定，試劑盒在有效期內(nèi)按推薦溫度保存，其活性降低率小于5%。

  為減小外部因素對(duì)試劑盒破壞前后檢測(cè)值的影響，實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境條件需盡量保持一致，尤其是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度、濕度及溫育條件。其次由同一實(shí)驗(yàn)員來進(jìn)行操作可減少人為誤差。

  注意：

  試劑盒內(nèi)酶標(biāo)條可拆卸，按實(shí)驗(yàn)需求可分多次使用;使用后的剩余試劑盒建議在首次實(shí)驗(yàn)后 1個(gè)月內(nèi)使用完畢。產(chǎn)品過期時(shí)間以盒子上的標(biāo)簽為準(zhǔn)，保質(zhì)期內(nèi)所有組分都確保是穩(wěn)定的。

  ELISA實(shí)驗(yàn)常見問題分析

  ELISA實(shí)驗(yàn)因靈敏度高，特異性強(qiáng)在生物科研上得到了廣泛的認(rèn)可，但對(duì)初學(xué)者而言，如不注意實(shí)驗(yàn)操作過程中的各個(gè)環(huán)節(jié)，可能會(huì)對(duì)終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生比較大的影響，比如實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)白板，顯色弱靈敏度低，花板無梯度背景高等現(xiàn)象。下面對(duì)以上實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象進(jìn)行一一解析。

  1.白板現(xiàn)象

  在完成所有實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行底物TMB溶液顯色后，酶標(biāo)板中所有孔的顏色均為無色，即無信號(hào)呈現(xiàn)。

  出現(xiàn)該現(xiàn)象的可能原因：

  a.試劑已過保質(zhì)期，不同批次稀釋液交叉使用。

  b.錯(cuò)加漏加檢測(cè)A，檢測(cè)B或者底物溶液TMB。

  c.洗板或者加樣過程中，酶標(biāo)記物被污染失活，稀釋液中含有酶抑制劑如疊氮吶等。

  d.配置稀釋液的蒸餾水可能被污染。

  e.洗滌液是濃縮型的，沒有按比例進(jìn)行稀釋。

  f.酶標(biāo)記物的活性和效價(jià)比較低。

  g.溶液的PH值不正確，一般稀釋液的PH值應(yīng)保持在7.2-7.4。

  2.顯色弱靈敏度低

  在完成所有實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行底物TMB溶液顯色后，酶標(biāo)板中孔的顯色比較淺，即只有微弱的信號(hào)呈現(xiàn)。

  出現(xiàn)該現(xiàn)象的可能原因：

  a.產(chǎn)品過有效期，試劑沒有按規(guī)定進(jìn)行適當(dāng)?shù)谋４妗?

  b.試劑，標(biāo)準(zhǔn)品或者樣品在使用前沒有平衡到室溫。

  c.少加了試劑的量或者加入試劑的稀釋比例不當(dāng)。

  d.洗板或者加樣過程中，酶標(biāo)物受污染失活。

  e.孵育時(shí)間和孵育溫度未達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

  f.洗滌液稀釋倍數(shù)不符合要求，洗板次數(shù)過多，洗板沖擊力過大，洗板浸泡時(shí)間過長。

  g.底物溶液TMB顯色時(shí)間太短。

  3.花板無梯度背景高

  在完成所有實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行底物TMB溶液顯色后，酶標(biāo)板中的孔有顏色但沒有梯度，背景也可能較高.

  出現(xiàn)該現(xiàn)象的可能原因：

  a.底物溶液TMB未置于陰涼避光處保存，實(shí)驗(yàn)前溶液已經(jīng)變藍(lán)。

  b.孵育溫度過高或者孵育時(shí)間過長，發(fā)生了較強(qiáng)的非特異性吸附。

  c.沒有按說明書要求洗板，特別是洗板時(shí)洗滌液的量少加了。

  d.加樣時(shí)沒有換槍頭造成交叉污染。

  e.花板現(xiàn)象：低濃度或者低活性的包被抗體或者檢測(cè)抗體，封閉不足導(dǎo)致的本底不穩(wěn)定，洗板不充分，包被板子的問題。

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