細胞培養狀態越來越差勁---消化環節的問題?
很多同學都遇到過這個問題，自己養的細胞開始的幾代長的還挺好的，可是穿過幾代之后就發現自己的細胞不行了，狀態越來越差勁了。對于這個問題，可以非常肯定地說，你的消化環節出問題了。你每一次的消化都讓細胞受到較大損傷了。所以，越長越差。
在消化的過程中，你加入胰酶后，所有細胞都在被胰酶消化著，但是我們忽視了一個問題就是，細胞的生長狀態是不一樣的，每一個細胞的貼壁情況也是不一樣的，有的貼壁牢固，有的貼壁沒有那么牢固的，所以，讓所有的細胞消化同樣的時間對細胞是不公平的，他們受到了差別待遇當然會有脾氣啊。我后來對消化的方法進行了改良，我稱之為四步消化法，以難消化細胞為例，具體操作如下：
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先不加胰酶，倒掉舊培養基加入少量新培養基洗 1-2 遍。這是前奏，即為一步，目的是將漂浮著的死細胞之類盡量洗掉。
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然后再加入少量新培養基直接吹打一遍，這一遍是把貼壁不牢固的細胞吹打下來。再用培養基洗一遍，兩次所得懸液混合傳入新瓶，即為第二步。你可以將這些傳入新瓶培養，以與后面胰酶消化過的細胞對比觀察看誰長的更好一點就知道該細胞對胰酶的敏感度了。
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吸干凈瓶內剩余液體，加入 0.3 mL 左右的胰酶潤洗一遍，吸掉棄之，再加入 1 mL 左右的胰酶消化。消化的同時置于顯微鏡下觀察，待細胞與細胞之間間隙明顯的時候立即吸掉胰酶與干凈子彈頭里備用，加入新培養基開始吹打，吹打 2-3 遍后吸取懸液于試管或新瓶暫存。用 2 mL 左右新培養基洗一遍與前面的混合。你也可以傳入新瓶培養，以與后面及前面的做對比。這是第三步。
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然后把前面剛吸出來的胰酶重新加進去瓶里繼續消化剩余的貼壁牢固的細胞。當然你也可以用新的胰酶，如果你們那比較富裕的話。繼續鏡下觀察，待剩余細胞間隙明顯，細胞開來的時候，吸掉胰酶，加入新培養基吹打。懸液傳入新瓶培養，根據實際情況你自己把握。這是第四步。
其實還可以有第五步，對于特別難消化的細胞和對胰酶特別敏感的細胞的話，你可以繼續加第五步甚至第六步。為了細胞更好的狀態，更漂亮的樣子，沒辦法，你必須分多批多次消化，這樣才能zui大限度地將胰酶對細胞的損傷降到zui低，保證細胞的狀態能夠zui優。
當然了，如果細胞是屬于那種很容易消化的細胞，像 RAW264.7，僅僅第二步就搞定了。就沒必要第三步第四步了。這個是需要你在實驗中能夠自己用心去體會的。建議你接手一個新細胞時把各步消化的細胞分別培養起來做比較，去摸索好細胞對胰酶的要求，便于你后續實驗的開展。
將細胞消化分成這幾步，除了是為了避免胰酶對細胞的損傷之外，還有一個更重要的作用就是，可以zui大程度地把細胞吹打成單個單個的狀態，不成片不連體。
因為細胞生長的時候肯定是要相互聯系，大部分的細胞都是要成片生長的，尤其是對于貼壁細胞，單個細胞貼壁之后長著長著就長到一片去了。但是如果是成片的細胞抱團的話，傳代后細胞是不能貼壁的，這樣抱團的細胞就會死亡。所以，消化傳代的時候一定要將細胞消化成單個單個的狀態，這個是非常考究你的功夫的。
細胞一旦脫落入懸液里你很難再將他吹打成單個，因為他沒有受力點了。很難找到受力點讓你對他吹打的力分散開細胞。所以必須要在細胞未脫落之前將其吹打開，受力點就是細胞貼壁的地方。這樣你就必須要嚴格控制好消化的程度，這和大師做飯掌握好火候是一樣的道理。
既要消化到容易吹打下來，又不能太過，一吹就整片脫落，要單個單個地往下掉。所以我才要分批分次地加胰酶消化就是為了保證不同生長狀態貼壁程度的細胞能夠都維持在好的受力點分散開。這個是很重要的一點。尤其是對于某些細胞這一點就是他活或死的致命點，像 Caco-2 細胞就是如此。
