qPCR：從菜鳥到高手進(jìn)階寶典
無 Ct 值出現(xiàn)
檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤：一般 SG 法采用 72℃ 延伸時(shí)采集，Taqman 法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸結(jié)束采集信號(hào)。
引物或探針降解：可通過 PAGE 電泳檢測(cè)其完整性。
模板量不足：對(duì)未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的zui高濃度做起。
模板降解：避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況。
Ct 值出現(xiàn)過晚（Ct >38）
擴(kuò)增效率低：反應(yīng)條件不夠優(yōu)化。設(shè)計(jì)更好的引物或探針，改用三步法進(jìn)行反應(yīng)。適當(dāng)降低退火溫度，增加鎂離子濃度等。
PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足。
PCR 產(chǎn)物太長： 一般采用 80-150 bp 的產(chǎn)物長度。
Ct 值比較靠后
Ct 值比較靠后，對(duì)實(shí)驗(yàn)有一定的影響，因?yàn)榻?jīng)過那么多次的循環(huán)，酶的活性有可能有所下降，這時(shí)候擴(kuò)增效率會(huì)有所改變（而定量 PCR 的理論基礎(chǔ)就是每次循環(huán)的擴(kuò)增效率我們認(rèn)為是確定的一個(gè)值）。因此zui好能夠把 Ct 值往前移。解決辦法可以將模板加以濃縮或者抽干之后用少量水去溶解。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的 slope 總大于４，每個(gè)梯度的平行 Ct 值差別大
這個(gè)斜率是＝1/LOG 10（擴(kuò)增效率），理論上擴(kuò)增效率＝2，斜率是 3.322。如果斜率大于 4，說明擴(kuò)增效率比較小。可以考查一下反應(yīng)體系是否合理，酶活是否正常，試劑盒的質(zhì)量是否有保證。只有在引物和模板處于zui適比例時(shí)才能得到比較滿意的擴(kuò)增效率，因此通過調(diào)節(jié) PCR 反應(yīng)體系中的引物終濃度來解決，可以做一些引物梯度來比較。
平行管的 Ct 值差別大可以考查一下自己實(shí)驗(yàn)操作是否規(guī)范，另外一種原因就是儀器本身的誤差也可能會(huì)導(dǎo)致 Ct 值差別比較大。
ROX 染料是什么作用？
ROX 的作用 ABI 宣稱是用來校準(zhǔn)加樣誤差的。但是據(jù)說 ROX 的作用實(shí)際上是用來校準(zhǔn)光程差的。即每個(gè)孔的熒光信號(hào)經(jīng)過濾光片在經(jīng)過聚焦到 CCD 的時(shí)候，走過的光程是不一樣的，這樣在 CCD 上成像的亮度就不一樣了。所以需要把這個(gè)差異用 ROX 來計(jì)算孔間差異有多大，然后差異系數(shù)去處理，實(shí)際的熒光信號(hào)。
如何確定熒光定量 PCR 的基線
基線就是背景值，因此就是曲線在沒有「起跳」之前的一段。在軟件上有一個(gè)地方可以輸入 ba
引物和探針對(duì) Ct 值有什么影響
先要保證引物能夠跟模板完全配對(duì)，第二，引物應(yīng)該是過量的。第三，引物不應(yīng)該形成引物二聚體。也說白了就是要保證體系的擴(kuò)增效率盡量地達(dá)到2并且沒有非特異性擴(kuò)增。在保證這個(gè)前提之下引物對(duì) Ct 值是沒有影響的。
如果一和第二沒有達(dá)到，應(yīng)該 Ct 值會(huì)變大。如果第三沒有達(dá)到那么 Ct 值應(yīng)該變小。探針應(yīng)該與模板完全配對(duì)，并且有一定的長度，濃度過量。保證探針能夠特異性地完全結(jié)合在模板上。
