養細胞是一件戳心戳肺的事。你要像照顧小孩一樣仔細對待，愛護她，呵護她。如果你照顧的時候能注意這些問題，會讓你的細胞養的更好。下面就將養細胞的注意事項跟大家交流一下。

1.冷凍管應如何解凍？

取出冷凍管后，須立即放入 37 ℃ 水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在 1 分鐘內全部融化，并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全，預防冷凍管的爆裂。

2.細胞冷凍管解凍培養時，是否應馬上去除 DMSO？

除少數特別注明對 DMSO 敏感的細胞外，大部分細胞株（包括懸浮性細胞），在解凍之后，應直接放入含有 10~15 ml 新鮮培養基的培養角瓶中，待隔天再置換新鮮培養基以去除 DMSO 即可，如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附的問題。

3.可否使用與原先培養條件不同的培養基？

不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應的細胞培養基，若驟然使用和原先提供培養條件不同的培養基，細胞大都無法立即適應，造成細胞無法存活。

4.可否使用與原先培養條件不同的血清種類？

不能。血清是細胞培養上一個為重要的營養來源，所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生大的影響。來自不同物種的血清，在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。

5.何謂 FBS，FCS，CS，HS？

FBS （fetal bovine serum） 和 FCS （fetal calf serum） 是相同的意思，兩者都是指胎牛血清， FCS 是錯誤的使用字眼，請不要再使用。CS （calf serum） 則是指小牛血清。HS （horseserum） 則是指馬血清。

6.培養細胞時應使用 5% 或 10% CO₂？或根本沒有影響？

一般培養基中大都使用 HCO₃^-/CO₃^2-/H⁺ 作為 pH 的緩沖系統，而培養基中 NaHCO₃ 的含量將決定細胞培養時應使用的 CO₂ 濃度。當培養基中 NaHCO₃ 含量為每公升 3.7 g 時，細胞培養時應使用 10% CO₂；當培養基中 NaHCO₃ 為每公升 1.5 g 時，則應使用 5% CO₂ 培養細胞。

7.何時須更換培養基？培養基中是否須添加抗生素？

視細胞生長密度而定，或遵照細胞株基本數據上的更換時間，按時更換培養基即可。

除于特殊篩選系統中外，一般正常培養狀態下，培養基中不應添加任何抗生素。

8.附著性細胞繼代時所使用的 trypsin-EDTA 濃度？應如何處理？

一般使用的 trypsin-EDTA 濃度為 0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于 –20 ℃，避免反復冷凍解凍造成 trypsin 的活性降低，并可減少污染的機會。

9.懸浮性細胞應如何繼代處理？

一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養角瓶中，稀釋細胞濃度即可，若培養液太多時，可將培養角瓶口端稍微抬高，直到無法容納為止。分瓶時取出一部分含細胞的培養液至另一新的培養角瓶，加入新鮮培養基稀釋至適當濃度，重復前述步驟即可。

10.欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應為多少轉速？

欲回收動物細胞，其離心速率一般為 1 000 rpm，5~10 分鐘，過高的轉速，將造成細胞死亡。

11.細胞的接種密度為何？

依照細胞株基本數據上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長的重要原因之一。

12.細胞冷凍培養基的成分為何？

動物細胞冷凍保存時常使用的冷凍培養基是含 5~10% DMSO （dimethyl sulfoxide） 和 90~95 % 原來細胞生長用的新鮮培養基均勻混合。注意：由于 DMSO 稀釋時會放出大量熱能，故不可將 DMSO 直接加入細胞液中，必須使用前先行配制完成。

13.DMSO 的等級和無菌過濾的方式為何？

冷凍保存使用的 DMSO 等級，必須為 Tissue culture grade 的 DMSO （如 Sigma D2650），其本身即為無菌狀況，次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于 4 ℃，避免反復冷凍解凍造成 DMSO 的裂解而釋出有害物質，并可減少污染的機會。若要過濾 DMSO，則須使用耐 DMSO 的 Nylon 材質濾膜。

14.冷凍保存細胞的方法？欲冷凍保存時，細胞冷凍管內應有多少細胞濃度？

冷凍保存方法一：冷凍管置于 4 ℃ 30~60 分鐘 →（-20 ℃ 30 分鐘） → -80 ℃ 16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽 vapor phase 長期儲存。

冷凍保存方法二： 冷凍管置于已設定程序的可程序降溫機中每分鐘降 1~3 ℃ 至 –80 ℃ 以下， 再放入液氮槽 vapor phase 長期儲存。–20 ℃ 不可超過 1 小時，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入 –80 ℃ 冰箱中，存活率稍微降低一些。

冷凍管內細胞數目一般為 1x10⁶ cells/ml vial，融合瘤細胞則以 5x10⁶ cells/ml vial 為宜。

15.如何避免細胞污染？發生微生物污染時應如何處理？

細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉漿菌。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環境不佳、污染的血清和污染的細胞等。嚴格無菌操作技術、清潔的環境、與品質良好的細胞來源和培養基配制是減低污染的zui好方法。

如果細胞發生微生物污染，加入相應抗生素，直接滅菌后丟棄。

16.支原體 （mycoplasma）污染的細胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？對細胞培養有何影響？

不能以肉眼觀察出異狀。除有經驗的外，大多數遭受支原體污染的細胞株，無法以其外觀分辨。

支原體污染幾乎可影響所有細胞的生長參數，代謝及研究任一數據。故進行實驗前，必須確認細胞為 mycoplasma-free，實驗結果的數據方有意義。

偵測出細胞株有支原體污染時，應直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細胞株。

17.為何培養基保存于 4 ℃ 冰箱中，顏色會偏暗紅色，且 pH 值會越來越偏堿性？

培養基保存于 4 ℃ 冰箱中，培養基內的 CO₂ 會逐漸溢出，造成培養基越來越偏堿性，而培養基中的酸堿指示劑 （通常為 phenol red） 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養基偏堿的結果， 將造成細胞生長停滯或死亡。若培養基偏堿時，可以通入無菌過濾 CO₂，以調整 pH 值。

18.各種細胞培養用的 dish，flask 是否均相同？

不同廠牌的 dish 或 flask，其所 coating 的 polymer 不同，制造程序亦不同，雖對大部分細胞沒有太大的影響，唯有少數細胞則可能因使用廠牌不同， dish 或 flask 有生長差異。

19.購買的細胞死亡或存活率不佳可能原因？細胞冷凍管解凍后，為何會有細胞數目太少的情形？

研究人員在細胞培養時出現存活率不佳，常見原因可歸納為：培養基使用錯誤或培養基品質不佳；血清使用錯誤或血清的品質不佳；解凍過程錯誤；冷凍細胞解凍后，加以洗滌細胞和離心；懸浮細胞誤認為死細胞；培養溫度使用錯誤；細胞置于 –80 ℃ 太久。

研究人員在冷凍細胞培養時出現細胞數目太少，大都是因為離心過程操作上的失誤，造成細胞的物理性損傷，以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心，應待細胞生長隔夜后再更換培養基即可。

20.收到的冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落的原因？

冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫，是因熱脹冷縮的物理現象，冷凍管有可能因此而造成細胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時，均應立刻將冷凍管再一次扭緊。

21.如何選用特殊細胞系培養基？

培養某一類型細胞沒有固定的培養條件。在 MEM 中培養的細胞，很可能在 DMEM 或 M199 中同樣很容易生長。總之，xuan MEM 做粘附細胞培養，RPMI-1640 做懸浮細胞培養是一個好的開始，各種目的無血清培養zui好xuan AIM V（12005）培養基（SFM）。

22.L-谷氨酰胺在細胞培養中重要嗎？它在溶液中不穩定嗎？

L-谷氨酰胺在細胞培養時是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有終定論。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。

23.GlutaMAX-I 是什么？培養細胞如何利用 GlutaMAX-I？這個二肽有多穩定？

GlutaMAX-I 二肽是一個 L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩定的 alpha-氨基用 L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放 L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I 二肽非常穩定，即使在 121 磅滅菌 20 分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎完全降解。

24.什么培養基中可以省去加酚紅？培養基中丙酮酸鈉的作用是什么？

酚紅在培養基中被用來作為 PH 值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素）。為避免固醇類反應，培養細胞，尤其是哺乳類細胞時，用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養基。

丙酮酸鈉可以作為細胞培養中的替代碳源，盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細胞也可以代謝丙酮酸鈉。

25.為什么目錄上說 Hank's 平衡鹽溶液 （HBS） 在空氣中使用，不需要 CO₂ 培養箱？HBS 和 Earle's 平衡鹽溶液 （EBS） 有什么本質的功能差別？

HBS 和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平，在 Eagles （2.2 g/L） 中比在 Hanks （0.35 g/L） 中高。碳酸氫鈉需用高水平的 CO₂ 平衡，以維持溶液的 PH 值。Eagles 液在空氣水平的 CO₂ 中，溶液會變堿，Hanks 液在 CO₂ 培養箱中會變酸。如果希望在 CO₂ 培養箱中保存組織，需要用 Eagles 液，如果僅僅是清洗將要在細胞培養基中儲存的組織，用 Hanks 液就可以了。

26.3二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時加入 EDTA 的目的是什么？

二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA 用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前，用 EDTA 清洗細胞，以消除來自培養基中所有的二價離子。

27.其他注意事項

• 當在無血清培養基中添加抗生素時，降低至少在有血清培養基中所使用濃度的 50%。血清蛋白會結合和滅活一些抗生素。在無血清培養條件下，抗生素不被滅活，可能對于細胞達到毒性水平。

   

• 一旦您在新鮮培養基中添加了血清和抗生素時，您應該在兩到三周內使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。

   

• 大部分添加物和試劑多可以凍融 3 次，如果次數更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會影響它的性能。

   

• 在溶解的一周內使用貯存在 4℃ 冰箱中的液體胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在 4℃ 就可能開始降解，如果在室溫下放置超過 30 分鐘，就會變得不穩定。

   

• 為了保持 CO₂ 培養箱水盤清潔，需定期 （至少每兩周一次） 用無菌蒸餾水或無菌去離子水更換。