問題

序號

可能原因

解決方法

顯色淡，靈敏度偏低

1

 試劑盒未充分平衡

試劑盒從2～8℃冰箱取出后打開盒蓋，于室溫平衡至少20分鐘，確保所有試劑已平衡至室溫（約25℃）

2

 樣品不適合做ELISA檢測

樣品一般選擇培養上清、血清、血漿。其他樣品形式可能不適合做ELISA檢測或者需要優化檢測的條件（例如稀釋液的成分）

3

 酶標板在貯存或洗后拍干時過分干燥

防止板過于干燥

4

 包被抗體遭到破壞

操作溫和，移液槍不能碰到孔底

5

 樣本和抗體孵育條件不合適

按照說明書條件，建議孵育過程中全程振蕩孵育。

6

 洗滌浸泡時間過長

按照說明書操作。勿人為增加浸泡時間；

7

 偶聯HRP試劑污染

棄去試劑，重新配置

8

 錯誤的稀釋偶聯HRP試劑

棄去試劑，重新配置

9

 TMB底物孵育時間過短，因非人為因素影響，需要優化孵育時間

確定合適的孵育時間：人為判定-zui高濃度的標準品出現深藍色；S4-5有淡藍色；機器判定620 nm波長下測定OD值達到0.6-0.65

10

 樣本濃度過高或存在基質效應

建議做不同稀釋倍數，確認樣本zui佳稀釋倍數。

11

 酶標儀濾光片設置有問題或者波長選擇不對

確認儀器設置及選擇正確的波長檢測。

12

 酶標板不適合做ELISA

不能使用細胞培養板，建議使用ELISA專用高吸附力板子。

背景深，全部呈有色（通常的Elisa背景值OD<0.2）

1

 洗滌不充分，洗后未拍干，樣品中其它成分殘留或酶標記物殘留

洗液準確配制；充分洗滌，靜置15秒，徹底拍干。加樣或加酶拍板的濾紙應棄去不用，不要反復使用，否則易造成污染。

2

 底物污染，未避光保存，出現顏色

棄去底物，重新配置

3

 樣品稀釋液污染

棄去稀釋液，重新配置

4

 吸頭重復使用，未洗凈或消毒不徹底

吸頭盡可能一次性使用

5

 不正確的孵育時間，溫度（尤其是底物孵育的時間）

zui為常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。完全按照說明書要求。

6

 偶聯抗體（streptavidin-HRP）濃度過高

按照說明書調整到zui佳的濃度

7

 ELISA板子不正確的貯存

酶標板貯存于2-8 ℃；使用結合力低點的Elisa板

8

 沒有正確封閉

在標準品稀釋液中加入動物蛋白或延長封閉時間

9

 樣本溶血嚴重

建議使用非溶血或輕微溶血樣本，嚴重溶血樣本會導致背景偏高。

重復性不佳，高CV值

1

 樣品不均一

加樣前充分混勻樣品，取樣確保移液位置一致；

2

 包被板表面遭到破壞

洗板加樣時盡量小心，避免破壞板的包被表面

3

 孔與孔之間的交叉污染

孵育后取下蓋子小心操作，避免孔與孔的污染；封板膜不能重復使用

4

 加樣量不一致

樣品稀釋前應充分混勻，盡可能使用同一移液器并裝緊吸嘴

5

 邊緣效應（外周孔顯色較中心孔深）

孵育時盡量100 rpm旋轉混勻

6

 微量加樣不準確

保證微量加樣的準確性和均一性

7

 不正確的洗滌

洗液準確配制；充分洗滌，靜置15秒，確定每一步的洗滌

出現白板，陽性對照不顯色

1

 顯色液變質

geng換新的顯色液

2

 洗滌液配制有誤

請按說明書所示稀釋倍數配制

3

 未加酶結合物而認為已加入

注意不要漏加

4

 終止液誤作洗滌液稀釋或當底物液使用

每次加液前均應看清標簽

5

 標準品稀釋方法錯誤/或標準品有問題

請按照說明書所示配置說明書，注意單位和稀釋倍數

6

 不同試劑盒或不同批號的試劑混用

建議使用同批次試劑盒。不能混用不同試劑盒或不同批號的試劑。

不正常的標準曲線

1

 錯誤的方法重懸標準品

 加入正確量的溶液重懸標準品，重懸充分

2

 標準品稀釋錯誤

 按照說明書要求稀釋標準品

3

 標準品污染

 使用一次性的滅菌吸頭， 標準品貯存于2-8 ℃

4

 錯誤的倍比稀釋步驟

 按照說明書倍比稀釋標準品

5

 波長選擇錯誤

TMB為底物和以OPD為底物的試劑盒均有使用，而 前者比色波長為450nm，后者為492nm。雙波長比色分析優于單波長。

6

 標準品混用

 不同批號試劑勿混用

7

 試劑盒在運輸途中時間太長，溫度太高，標準品失活

 盡量縮短運輸時間，夏季應放冰塊降溫

8

 ELISA未終止而直接檢測450nm和620nm

TMB顯色需終止后檢測，否則會出現620nm比450nm讀數高的現象。（數值仍有梯度規律）

樣品或標準品OD超出正常范圍

1

 錯誤的樣品或標準品的稀釋

 完全按照說明書稀釋

2

 偶聯抗體濃度過高

 按照說明書調整到zui佳的濃度

3

 TMB底物孵育時間過長

 調整到合適的孵育時間

4

 樣品或標準品污染

 避免污染

5

 錯誤的孵育時間或溫度

 完全按照說明書

6

 孵育時未加蓋導致溶液揮發和污染

 貼封片或加蓋

標曲很好，但是樣本無法計算到數值

1

 標曲選擇不合適

選擇zui合適的標曲擬合；

2

 樣本含量很低，低于靈敏度無法被檢測到

嘗試濃縮樣本或使用高敏ELISA試劑盒檢測

3

樣本含量很高，超過標曲

建議進行預實驗摸索稀釋倍數，確保樣本OD值落在標曲范圍內

標曲高濃度間無明顯趨勢

1

如ODdui值靠譜，但是僅無梯度，則顯色過度

TMB顯色體系中建議根據S1，S2顏色進行判斷，當S1，S2深藍色，有明顯梯度，S5有淡藍色時即可終止。

2

僅作單波長檢測。

由于參考波長讀取非特異性檢測，如指紋、劃痕、水漬等，對結果也有影響。建議zui終結果以雙波長為zui準確。