如何提高蛋白質的表達量？
相信如何提高目的重組蛋白的誘導表達量是很多同學在研究中都會遇到的問題。泡了無數論壇，看了無數帖子，嘗試過IPTG的誘導濃度、培養基成分、誘導溫度、誘導時間，甚至讓別的公司幫忙做密碼子優化（將目的片段通過全基因合成的方式合成出來）?？偟膩碚f，提高IPTG濃度是可以提高目的蛋白的誘導表達量的，但一般也就用到1mM的濃度，再高對細胞有毒性；
培養基營養越豐富，表達量越高，所以如果追求表達量的話，就不要用LB培養基了，用自動誘導培養基吧；
誘導溫度，溫度越低表達量越低，但是可溶的比例一般來說會越高，所以如果追求表達量可以嘗試37℃或者42℃（沒試過42℃）；誘導時間，這個跟培養基成分及供氧情況很有關系，如果供氧不足/營養不夠，提高時間會起到反效果。
綜合而言，一般用的重組蛋白誘導表達條件是固定的，有時候要追求可溶表達，頂多就調整下誘導溫度（25℃）。條件就是：自動誘導培養基（不用額外的IPTG），37℃，20h。一般來說大分部蛋白的表達量都還可以。
但有些蛋白的表達量不行，或者某些蛋白需要長期大量使用，因此提高這些重組蛋白的誘導表達量就十分有必要了，如果進一步提高呢？
我們都知道，蛋白質的表達量和蛋白質的翻譯效率有關，翻譯效率又跟mRNA的二級結構又有關系，如果mRNA形成了復雜的二級結構，會導致核糖體無法順暢的將整個mRNA讀通，甚至會提前從mRNA上掉下來。一般公司號稱的密碼子優化，也就是通過替換掉一些稀有密碼子，顯然如果不從二級結構上考慮的話，是沒法提高蛋白質的表達量的，而事實也確實如此。在公司做研發的幾年中，做過多個蛋白的密碼子優化（通過全基因合成的方式），結果差強人意。
今天介紹的方法，不是從二級結構上來預測的（據我所知，目前沒有比較準確的方法來預測mRNA的二姐結構），而是一種簡單、高效的方法：通過優化目的基因的5'部分DNA序列，而且不需要通過軟件預測，完全隨機，包含所有可能（理論上），且不改變氨基酸序列。
原理：蛋白質的翻譯效率很大程度上跟翻譯起始效率有關，因此mRNA的5'端必須得很好翻譯，好不要有復雜的二級結構；通過PCR的方法在基因的5‘端引入簡并序列，構建克隆，挑選多個克隆，誘導表達之，SDS-PAGE電泳檢測表達量的高低，挑選高表達克隆進行測序。
實驗步驟：
1.設計目的重組蛋白質的N端10-15個氨基酸的簡并序列。
2.引物合成上述簡并序列，同時設計合成目的基因反向引物。
3.PCR擴展目的基因，這樣在目的基因的5‘端就引入了兼并序列，同時不改變氨基酸序列。
4.雙酶切，插入到目標載體。
5.轉化。
6.挑選多個克隆（比如100-200個）到1.5ml EP管，直接誘導表達（記得帶上為改造克隆菌株的對照）。
7.SDS-PAGE檢測。
8.挑選高表達的多個克隆，測序。
綜合而言，一般用的重組蛋白誘導表達條件是固定的，有時候要追求可溶表達，頂多就調整下誘導溫度（25℃）。條件就是：自動誘導培養基（不用額外的IPTG），37℃，20h。一般來說大分部蛋白的表達量都還可以。
但有些蛋白的表達量不行，或者某些蛋白需要長期大量使用，因此提高這些重組蛋白的誘導表達量就十分有必要了，如果進一步提高呢？
我們都知道，蛋白質的表達量和蛋白質的翻譯效率有關，翻譯效率又跟mRNA的二級結構又有關系，如果mRNA形成了復雜的二級結構，會導致核糖體無法順暢的將整個mRNA讀通，甚至會提前從mRNA上掉下來。一般公司號稱的密碼子優化，也就是通過替換掉一些稀有密碼子，顯然如果不從二級結構上考慮的話，是沒法提高蛋白質的表達量的，而事實也確實如此。在公司做研發的幾年中，做過多個蛋白的密碼子優化（通過全基因合成的方式），結果差強人意。
今天介紹的方法，不是從二級結構上來預測的（據我所知，目前沒有比較準確的方法來預測mRNA的二姐結構），而是一種簡單、高效的方法：通過優化目的基因的5'部分DNA序列，而且不需要通過軟件預測，完全隨機，包含所有可能（理論上），且不改變氨基酸序列。
原理：蛋白質的翻譯效率很大程度上跟翻譯起始效率有關，因此mRNA的5'端必須得很好翻譯，好不要有復雜的二級結構；通過PCR的方法在基因的5‘端引入簡并序列，構建克隆，挑選多個克隆，誘導表達之，SDS-PAGE電泳檢測表達量的高低，挑選高表達克隆進行測序。
實驗步驟：
1.設計目的重組蛋白質的N端10-15個氨基酸的簡并序列。
2.引物合成上述簡并序列，同時設計合成目的基因反向引物。
3.PCR擴展目的基因，這樣在目的基因的5‘端就引入了兼并序列，同時不改變氨基酸序列。
4.雙酶切，插入到目標載體。
5.轉化。
6.挑選多個克隆（比如100-200個）到1.5ml EP管，直接誘導表達（記得帶上為改造克隆菌株的對照）。
7.SDS-PAGE檢測。
8.挑選高表達的多個克隆，測序。
