酶的提取、分離、純化及其活力測定
一、實驗目的
酶是植物體內具有催化作用的蛋白質，植物體內的生化反應，一般都是在酶的作用下進行的，沒有酶的催化反應，植物的生命也就停止了，因此對酶的研究是闡明生命現象本質中十分重要的部分。為要研究酶首先要將酶從組織中提取出來，加以分離、純化，不同的研究目的對酶制劑的純度要求也不相同，有些工作只需要粗的酶制劑即可，而有些工作則要求較純的酶制劑，需根據不同情況區別對待。在酶的提取和純化過程中，自始至終都需要測定酶的活性，通過酶活性的測定以監測酶的去向。
二、實驗原理
（一）酶的提取
1.酶的存在位置？
存在于動植物以及微生物的細胞的各個部位。
2.如何將酶從細胞中分離？
從高等植物中提取酶常遇到一些實際問題，首先是細胞中含有許多種酶，每種酶的濃度又很低，只占細胞總蛋白質中的極小部分（葉中的雙磷酸核酮糖羧化酶除外），而許多植物組織中蛋白質的含量又很低。此外，各種酶的存在狀態不同，有在細胞外的外酶，在細胞內的內酶，內酶中又有與細胞器一定結構相結合的結合酶，也有的存在于細胞質中，提取時都應區別對待，作不同處理。如果酶僅存在于細胞質中，只要將細胞破碎，酶就會轉移到提取液中；但如果是與細胞器（如細胞壁、細胞核、線粒體、原生質膜、微粒體等）緊密結合的酶，這時如僅僅破碎細胞還不夠，還需要用適當的方法將酶從這些結構上溶解下來。其次，細胞中存在抑制物質，如酚，酸，離子等，它們通常在液泡中，當細胞破碎時，這些物質象蛋白質一樣從細胞中釋放出來，進入提取液中，特別是酚類物質，具有游離的酚羥基，能與蛋白質肽鍵的氧原子形成強的氫鍵，不能為一般的實驗方法，如透析和凝膠過濾所解離。酚易氧化產生醌，醌為一種強氧化劑，會使蛋白質的功能團發生氧化或發生聚合，使蛋白質上的反應基團，如—SH，—NH2，通過1，4—加成反應而發生不可逆的聚合作用，使酶失活，也使植物組織和提取液產生棕色，以致影響酶活性的測定。因此如果沒有特殊需要，一般常選用植物的非綠色部分或者黃化的幼苗，在這些組織中一般酚類化合物含量較低。在提取過程中為了盡量減少酚類的影響，一般提取液常選用高pH值的緩沖溶液，因為在高pH值時，酚類大部游離而不與蛋白質形成強的氫鍵，但高pH值促進酚類氧化，同時降低酚類吸附劑（如PVP）的有效性，通常采用pH6.7梍7.2。已經知道PVP能與游離酚羥基形成強的氫鍵復合物，是酚類化合物的有效結合劑。在提取線粒體時加入可溶性PVP，提取可溶性酶時加入不溶性交聯PVP（Polyvinyl polypyrrolidone，簡稱PVPP，或Polyclar AT），能有效地降低提取液中酚的含量。PVPP含有微量金屬元素及PVP單體，可加10% HCl煮沸10分鐘，用NaOH中和，再用水洗幾次，直至中性，純化后的PVPP不必干燥就可直接應用。
植物細胞有堅韌的細胞壁，需要強烈的方法去破碎，少量樣品可用研缽加石英砂研磨，或用玻璃勻漿器。大量樣品則需用電動勻漿器。為減低研磨或勻漿過程中發熱，所用器皿和溶液需要預冷，提取液的用量一般為組織的1梍5倍，用量大些有利于提高得率，但工作量大，一般寧可用量小些，將殘渣再提取一次。提取勻漿時加入酚類結合劑PVPP，金屬螯合劑 Na2─EDTA，以及─SH化合物以保護蛋白質，或加入非離子型去垢劑如Triton X─100，以增加蛋白質的可溶度，常用于與膜脂結合的酶。總之，可以通過試驗以確定提取蛋白質的佳條件。
（二）分離和純化
1.酶的粗提液是否只有酶，有沒有其它物質？
上面制備得到的提取液中，除含有所需要的酶外，還含有其他蛋白質，以及其他大分子和小分子化合物雜質。
2. 如何將酶從粗提液只分離純化？
要在許多蛋白質的混合物中分離出所需要的酶蛋白，目前常用的方法有鹽析法，往層析法，薄膜超濾法，親和層析法，電泳法等。在大體積的提取液中一般先采用硫酸銨分級鹽析沉淀。鹽析法是提純酶使用早的方法之一，迄今仍廣泛使用，而且在高濃度的鹽溶液中酶蛋白不易變性而失去活性，利于工作在室溫中進行。不同蛋白質在高濃度的鹽溶液中溶解度有不同程度的降低，鹽析法就是利用這一性質，將不同性質的蛋白質分離，選擇合適飽和度的硫酸銨，使沉淀的蛋白質的酶活性大。大多數酶的活性存在于35梍45%和45梍55%飽和度硫酸銨沉淀的部分，但也有存在于65梍80%飽和度的（如花椰菜根的過氧化物酶）。沉淀的蛋白質經離心后收集之，再溶于少量緩沖溶液中，經透析或凝膠柱過濾，以除去硫酸銨及其他小分子雜質，然后再經過柱層析分離。由于吸附劑的不同，又有吸附柱層析、離子交換柱層析和凝膠過濾柱層析等。對于不同的支持物采用的洗脫方法也不同，分子篩類型凝膠過濾柱層析，洗脫液只要用一定濃度的緩沖液就可以了，亦即等濃度洗脫。對于吸附柱和離子交換柱層析，往往要采用濃度梯度溶液進行洗脫，方便的是線性梯度濃度，當然用非線性梯度會得到好的分離效果。柱層析一般都需要自動收集儀，如果能配用蛋白質檢測儀就好了。目前柱層析和硫酸銨分級沉淀一樣，已經成為一種常規的酶的分離提純的步驟之一了。
近年來純化酶常用的一種有效方法為親和層析。主要利用酶和底物、抑制劑或輔酶具有一定的結合能力，這一性質即可用來分離、提純酶。首先選擇一支持物，如瓊脂糖（Sepharose）將底物、競爭性抑制劑或輔酶，以共價鍵的形式連接到支持物上，然后把含有酶的溶液，流過裝有專一性底物、競爭抑制劑或輔酶的層析柱，酶即被保留在支持物上，再經過充分洗滌除去未被吸附的雜質，然后用含有一定濃度的底物或競爭性抑制劑或輔酶的緩沖液，進行競爭性洗脫。如果親和劑選擇合適，往往能得到較高純度的酶，是酶分離、純化中既方便又有效的一種方法。
（三）酶活力的測定
酶的活力表現為催化某一反應的速度，反應速度越大，酶的活力也越大，酶催化的反應速度可以用單位時間內底物的消耗量或產物的積累量來表示。由于酶的催化作用和周圍環境的關系十分密切，環境的溫度、pH、離子強度等都對酶的活力有很大的影響，因此測定酶活力時應該使這些條件保持恒定。
酶活力的大小常以每mg酶蛋白每分鐘所分解的底物量（或生成的產物量）μmol數表示之。測定酶活性的方法很多，常因反應的底物和產物的性質不同可選用不同的方法，應用廣泛的是比色法或分光光度法。凡反應系統中的化合物在紫外區或可見光區有吸收峰的都可以用這種方法進行測定。如果酶催化的是一需氧反應，如氧化酶，則可用測壓法或氧電極法。如果催化的反應系統中需要ATP或產生ATP，如一些激酶；或是有NAD存在，如一些脫氫酶和氧化還原酶；或者反應產生H2O2，如一些氧化酶，這些酶的活性可以用生物發光或化學發光方法進行測定。總之，測定酶活性的方法很多，應根據具體情況選擇合適的方法。
三、材料、儀器與試劑
要求用硫酸銨分級沉淀部分純化過氧化物酶。
（一）、材料：花椰菜根
（二）、儀器（儀器的選擇在實驗開始前由學生在預習報告中提出方案后教師審定）
冰凍離心機；751型分光光度計；電磁攪拌器；組織搗碎機；天平；量筒；移液管；燒杯；透析袋。
（三）、試劑（試劑的選擇在實驗開始前由學生在預習報告中提出方案后教師審定后并配制）
PVPP；硫酸銨；0.02mol/L KH2PO4溶液；0.lmol/L 磷酸鉀緩沖液，PH6.0。
四、實驗操作
(1)酶的提取：取花椰菜根（或其他植物材料）用自來水洗凈，吸干水分，稱得鮮重，按每g5ml提取溶液，加入預冷的0.02mol/L KH2PO4溶液，加入材料鮮重10%PVPP（預先經過純化，用蒸餾水吸脹）。在預冷的組織搗碎機中攪成勻漿。勻漿倒在燒杯中，于冰箱中浸提1小時，用 4層紗布或尼龍布袋過濾，濾液于18000r/min冷凍離心15分鐘，棄去沉淀，上清液即為酶的粗提取液。
(2)硫酸銨分級沉淀：用量筒量得酶液的體積，吸取5ml留作酶活性及蛋白質含量分析，保存在冰箱中，其余酶液加入固體硫酸銨，使達35%飽和度（參閱附表8），加硫酸銨時要緩慢，以避免造成局部濃度過高，在電磁攪拌器上邊攪拌邊加入。然后置冰箱中半小時，離心如上。分別收集上清液和沉淀，上清液中再加入硫酸銨使達65%飽和度，再離心，收集沉淀和上清液。按這樣的方法分別收集0梍35%、35梍65%、65梍80%、80梍飽和度硫酸銨沉淀。每部分沉淀分別復溶于1/20原始提取液體積的0.02mol/L KH2PO4溶液中，裝入透析袋中，用大量KH2PO4溶液（2000ml）在冰箱中進行透析過夜，其間換KH2PO4溶液約4次，直至無SO42-析出為止（用BaCl2溶液檢查）。透析完畢后，分別量得適量體積，保存于冰箱中備用。
(3)蛋白質含量的測定：將原提取液及經硫酸銨分級沉淀得到的各分部溶液，用Folin試劑或考瑪斯藍G—250（參閱實驗56）測定蛋白質含量，以牛血清蛋白作標準。
(4)酶活性的測定：以愈創木酚為底物測定酶活性。
(5)將結果填入表中。
酶是植物體內具有催化作用的蛋白質，植物體內的生化反應，一般都是在酶的作用下進行的，沒有酶的催化反應，植物的生命也就停止了，因此對酶的研究是闡明生命現象本質中十分重要的部分。為要研究酶首先要將酶從組織中提取出來，加以分離、純化，不同的研究目的對酶制劑的純度要求也不相同，有些工作只需要粗的酶制劑即可，而有些工作則要求較純的酶制劑，需根據不同情況區別對待。在酶的提取和純化過程中，自始至終都需要測定酶的活性，通過酶活性的測定以監測酶的去向。
二、實驗原理
（一）酶的提取
1.酶的存在位置？
存在于動植物以及微生物的細胞的各個部位。
2.如何將酶從細胞中分離？
從高等植物中提取酶常遇到一些實際問題，首先是細胞中含有許多種酶，每種酶的濃度又很低，只占細胞總蛋白質中的極小部分（葉中的雙磷酸核酮糖羧化酶除外），而許多植物組織中蛋白質的含量又很低。此外，各種酶的存在狀態不同，有在細胞外的外酶，在細胞內的內酶，內酶中又有與細胞器一定結構相結合的結合酶，也有的存在于細胞質中，提取時都應區別對待，作不同處理。如果酶僅存在于細胞質中，只要將細胞破碎，酶就會轉移到提取液中；但如果是與細胞器（如細胞壁、細胞核、線粒體、原生質膜、微粒體等）緊密結合的酶，這時如僅僅破碎細胞還不夠，還需要用適當的方法將酶從這些結構上溶解下來。其次，細胞中存在抑制物質，如酚，酸，離子等，它們通常在液泡中，當細胞破碎時，這些物質象蛋白質一樣從細胞中釋放出來，進入提取液中，特別是酚類物質，具有游離的酚羥基，能與蛋白質肽鍵的氧原子形成強的氫鍵，不能為一般的實驗方法，如透析和凝膠過濾所解離。酚易氧化產生醌，醌為一種強氧化劑，會使蛋白質的功能團發生氧化或發生聚合，使蛋白質上的反應基團，如—SH，—NH2，通過1，4—加成反應而發生不可逆的聚合作用，使酶失活，也使植物組織和提取液產生棕色，以致影響酶活性的測定。因此如果沒有特殊需要，一般常選用植物的非綠色部分或者黃化的幼苗，在這些組織中一般酚類化合物含量較低。在提取過程中為了盡量減少酚類的影響，一般提取液常選用高pH值的緩沖溶液，因為在高pH值時，酚類大部游離而不與蛋白質形成強的氫鍵，但高pH值促進酚類氧化，同時降低酚類吸附劑（如PVP）的有效性，通常采用pH6.7梍7.2。已經知道PVP能與游離酚羥基形成強的氫鍵復合物，是酚類化合物的有效結合劑。在提取線粒體時加入可溶性PVP，提取可溶性酶時加入不溶性交聯PVP（Polyvinyl polypyrrolidone，簡稱PVPP，或Polyclar AT），能有效地降低提取液中酚的含量。PVPP含有微量金屬元素及PVP單體，可加10% HCl煮沸10分鐘，用NaOH中和，再用水洗幾次，直至中性，純化后的PVPP不必干燥就可直接應用。
植物細胞有堅韌的細胞壁，需要強烈的方法去破碎，少量樣品可用研缽加石英砂研磨，或用玻璃勻漿器。大量樣品則需用電動勻漿器。為減低研磨或勻漿過程中發熱，所用器皿和溶液需要預冷，提取液的用量一般為組織的1梍5倍，用量大些有利于提高得率，但工作量大，一般寧可用量小些，將殘渣再提取一次。提取勻漿時加入酚類結合劑PVPP，金屬螯合劑 Na2─EDTA，以及─SH化合物以保護蛋白質，或加入非離子型去垢劑如Triton X─100，以增加蛋白質的可溶度，常用于與膜脂結合的酶。總之，可以通過試驗以確定提取蛋白質的佳條件。
（二）分離和純化
1.酶的粗提液是否只有酶，有沒有其它物質？
上面制備得到的提取液中，除含有所需要的酶外，還含有其他蛋白質，以及其他大分子和小分子化合物雜質。
2. 如何將酶從粗提液只分離純化？
要在許多蛋白質的混合物中分離出所需要的酶蛋白，目前常用的方法有鹽析法，往層析法，薄膜超濾法，親和層析法，電泳法等。在大體積的提取液中一般先采用硫酸銨分級鹽析沉淀。鹽析法是提純酶使用早的方法之一，迄今仍廣泛使用，而且在高濃度的鹽溶液中酶蛋白不易變性而失去活性，利于工作在室溫中進行。不同蛋白質在高濃度的鹽溶液中溶解度有不同程度的降低，鹽析法就是利用這一性質，將不同性質的蛋白質分離，選擇合適飽和度的硫酸銨，使沉淀的蛋白質的酶活性大。大多數酶的活性存在于35梍45%和45梍55%飽和度硫酸銨沉淀的部分，但也有存在于65梍80%飽和度的（如花椰菜根的過氧化物酶）。沉淀的蛋白質經離心后收集之，再溶于少量緩沖溶液中，經透析或凝膠柱過濾，以除去硫酸銨及其他小分子雜質，然后再經過柱層析分離。由于吸附劑的不同，又有吸附柱層析、離子交換柱層析和凝膠過濾柱層析等。對于不同的支持物采用的洗脫方法也不同，分子篩類型凝膠過濾柱層析，洗脫液只要用一定濃度的緩沖液就可以了，亦即等濃度洗脫。對于吸附柱和離子交換柱層析，往往要采用濃度梯度溶液進行洗脫，方便的是線性梯度濃度，當然用非線性梯度會得到好的分離效果。柱層析一般都需要自動收集儀，如果能配用蛋白質檢測儀就好了。目前柱層析和硫酸銨分級沉淀一樣，已經成為一種常規的酶的分離提純的步驟之一了。
近年來純化酶常用的一種有效方法為親和層析。主要利用酶和底物、抑制劑或輔酶具有一定的結合能力，這一性質即可用來分離、提純酶。首先選擇一支持物，如瓊脂糖（Sepharose）將底物、競爭性抑制劑或輔酶，以共價鍵的形式連接到支持物上，然后把含有酶的溶液，流過裝有專一性底物、競爭抑制劑或輔酶的層析柱，酶即被保留在支持物上，再經過充分洗滌除去未被吸附的雜質，然后用含有一定濃度的底物或競爭性抑制劑或輔酶的緩沖液，進行競爭性洗脫。如果親和劑選擇合適，往往能得到較高純度的酶，是酶分離、純化中既方便又有效的一種方法。
（三）酶活力的測定
酶的活力表現為催化某一反應的速度，反應速度越大，酶的活力也越大，酶催化的反應速度可以用單位時間內底物的消耗量或產物的積累量來表示。由于酶的催化作用和周圍環境的關系十分密切，環境的溫度、pH、離子強度等都對酶的活力有很大的影響，因此測定酶活力時應該使這些條件保持恒定。
酶活力的大小常以每mg酶蛋白每分鐘所分解的底物量（或生成的產物量）μmol數表示之。測定酶活性的方法很多，常因反應的底物和產物的性質不同可選用不同的方法，應用廣泛的是比色法或分光光度法。凡反應系統中的化合物在紫外區或可見光區有吸收峰的都可以用這種方法進行測定。如果酶催化的是一需氧反應，如氧化酶，則可用測壓法或氧電極法。如果催化的反應系統中需要ATP或產生ATP，如一些激酶；或是有NAD存在，如一些脫氫酶和氧化還原酶；或者反應產生H2O2，如一些氧化酶，這些酶的活性可以用生物發光或化學發光方法進行測定。總之，測定酶活性的方法很多，應根據具體情況選擇合適的方法。
三、材料、儀器與試劑
要求用硫酸銨分級沉淀部分純化過氧化物酶。
（一）、材料：花椰菜根
（二）、儀器（儀器的選擇在實驗開始前由學生在預習報告中提出方案后教師審定）
冰凍離心機；751型分光光度計；電磁攪拌器；組織搗碎機；天平；量筒；移液管；燒杯；透析袋。
（三）、試劑（試劑的選擇在實驗開始前由學生在預習報告中提出方案后教師審定后并配制）
PVPP；硫酸銨；0.02mol/L KH2PO4溶液；0.lmol/L 磷酸鉀緩沖液，PH6.0。
四、實驗操作
(1)酶的提取：取花椰菜根（或其他植物材料）用自來水洗凈，吸干水分，稱得鮮重，按每g5ml提取溶液，加入預冷的0.02mol/L KH2PO4溶液，加入材料鮮重10%PVPP（預先經過純化，用蒸餾水吸脹）。在預冷的組織搗碎機中攪成勻漿。勻漿倒在燒杯中，于冰箱中浸提1小時，用 4層紗布或尼龍布袋過濾，濾液于18000r/min冷凍離心15分鐘，棄去沉淀，上清液即為酶的粗提取液。
(2)硫酸銨分級沉淀：用量筒量得酶液的體積，吸取5ml留作酶活性及蛋白質含量分析，保存在冰箱中，其余酶液加入固體硫酸銨，使達35%飽和度（參閱附表8），加硫酸銨時要緩慢，以避免造成局部濃度過高，在電磁攪拌器上邊攪拌邊加入。然后置冰箱中半小時，離心如上。分別收集上清液和沉淀，上清液中再加入硫酸銨使達65%飽和度，再離心，收集沉淀和上清液。按這樣的方法分別收集0梍35%、35梍65%、65梍80%、80梍飽和度硫酸銨沉淀。每部分沉淀分別復溶于1/20原始提取液體積的0.02mol/L KH2PO4溶液中，裝入透析袋中，用大量KH2PO4溶液（2000ml）在冰箱中進行透析過夜，其間換KH2PO4溶液約4次，直至無SO42-析出為止（用BaCl2溶液檢查）。透析完畢后，分別量得適量體積，保存于冰箱中備用。
(3)蛋白質含量的測定：將原提取液及經硫酸銨分級沉淀得到的各分部溶液，用Folin試劑或考瑪斯藍G—250（參閱實驗56）測定蛋白質含量，以牛血清蛋白作標準。
(4)酶活性的測定：以愈創木酚為底物測定酶活性。
(5)將結果填入表中。
