標(biāo)簽：細(xì)胞裂解液 古朵生物 溶液

  古朵資訊| 細(xì)胞裂解提取蛋白的步驟

  在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們常常需要證明實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組某些蛋白質(zhì)是多了還是少了，那么我們就需要先把細(xì)胞或組織中的蛋白質(zhì)提取出來(lái)進(jìn)行測(cè)量，今天古朵生物小編就給大家介紹一下細(xì)胞與組織蛋白質(zhì)提取的基本知識(shí)和步驟。

  蛋白樣品制備的原則：

  1.盡可能采用簡(jiǎn)單方法，以避免蛋白丟失;

  2.細(xì)胞和組織樣品的制備應(yīng)盡可能減少蛋白質(zhì)的降解，低溫和蛋白酶抑制劑可防止蛋白質(zhì)的降解;

  3.樣品裂解液應(yīng)新鮮制備，并分裝存于-80℃，勿反復(fù)凍融已制備好的樣品;

  4.通過(guò)超速離心清除其余雜質(zhì)。

  一般的理解方法分為溫和的裂解方法和劇烈的蛋白裂解方法。

  溫和的裂解方法

  用于組成比較簡(jiǎn)單的樣品，或分析某一特定的細(xì)胞器。

  (1)滲透裂解：血細(xì)胞、組織培養(yǎng)細(xì)胞

  (2)凍融裂解：細(xì)菌、組織培養(yǎng)細(xì)胞;液氮凍融

  (3)去污劑裂解：用去污劑溶解細(xì)胞膜、裂解細(xì)胞，釋放內(nèi)容物;用于組織細(xì)胞

  (4)酶裂解細(xì)胞：植物、細(xì)菌和真菌等含有細(xì)胞壁的細(xì)胞

  劇烈的蛋白裂解方法

  常用于難于破碎的細(xì)胞，如固體組織內(nèi)的細(xì)胞，或具有堅(jiān)硬細(xì)胞壁的細(xì)胞，如酵母細(xì)胞。

  (1)超聲波裂解法：細(xì)胞樣品

  (2)弗氏壓碎器：高壓下迫使細(xì)胞穿過(guò)小孔徑而產(chǎn)生剪切力，從而裂解細(xì)胞;常用于含有細(xì)胞壁的微生物、藻類(lèi)

  (3)研磨法：常用于固體組織、微生物;凍存于液氮中，隨后研磨成粉末

  (4)機(jī)械勻漿法：

  (5)玻璃珠勻漿法：利用劇烈振蕩的玻璃珠打破細(xì)胞壁;用于細(xì)胞懸液或微生物

  那么蛋白提取的步驟來(lái)了：

  所需器材：低溫高速離心機(jī)，勻漿攪拌器，超聲儀，真空泵，細(xì)胞掛勺等。

  所需試劑：RIPA裂解液，蛋白酶抑制劑(PMSF),無(wú)菌PBS等。

  蛋白樣品提取

  1、細(xì)胞蛋白的提取：

  1.根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要取出需要提取的細(xì)胞培養(yǎng)板，置于冰上，用吸引器吸除上清液。PS：所有操作均應(yīng)在在冰上進(jìn)行。

  2.每孔細(xì)胞(六孔板)中加入 1-2ml 4℃預(yù)冷的PBS溶液。平放輕輕搖動(dòng)十秒鐘清洗細(xì)胞，然后吸除洗液，共清洗洗細(xì)胞三次(目的是去除剩余的上清液)，后一次不吸除上清液。

  3. 用刮勺將細(xì)胞輕輕刮下，接著用移液器將細(xì)胞和上清液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，置入4度離心機(jī)(提前開(kāi)離心機(jī)預(yù)冷)，離心1.5min，棄去上清液。

  4.配置裂解液(所用裂解液為RIPA裂解液，可以使蛋白得到充分釋放)，每 1ml 裂解液加 10 μl PMSF(100mM)，搖勻置于冰上。(PMSF 要搖勻至無(wú)結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合)。PS：PMSF屬于蛋白酶抑制劑，可以減少蛋白質(zhì)的講解，另外的蛋白酶抑制劑還可以用cocktail，NaF，NaN3等，也可以同時(shí)加入多種蛋白酶抑制劑。

  5.將配置好的裂解液加入第3步獲得的細(xì)胞沉淀中，一般5*10^6個(gè)細(xì)胞加入100ul的裂解液，然后吹打重懸，使細(xì)胞充分裂解。

  6.用超聲儀進(jìn)一步裂解細(xì)胞：將細(xì)胞放置于冰上進(jìn)行超聲，一般功率選擇為15%左右，裂解時(shí)間為1分鐘(超聲2s，休息4s)，當(dāng)超聲一次后，離心管仍比較渾濁，可以間隔幾分鐘再次超聲。

  7.超聲結(jié)束后，將細(xì)胞于4度離心機(jī)，12000rpm離心 25min。

  8.將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移至1.5ml 離心管，保存于-80℃?zhèn)溆谩?

  2、組織中總蛋白的提取：

  1.將少量組織塊置于 1.5ml離心管中，加入500ul含PMSF的強(qiáng)RIPA裂解液，先用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎，當(dāng)組織較軟時(shí)(如腦組織)，接著用1ml槍頭不斷地吹打吸取，然后用勻漿器進(jìn)一步打碎組織，后用超聲儀進(jìn)行超聲裂解;當(dāng)組織較韌時(shí)(如肌肉組織)，可以直接用勻漿器打碎組織，后用超聲儀進(jìn)行超聲裂解。(裂解組織就是通過(guò)不同的方法讓組織塊不斷變小)。

  2.同上方法，將離心管置入 4度離心機(jī)，12000rpm離心25min，取上清分裝于1.5ml離心管中并置于-80℃保存。

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