elisa試劑盒實驗中的注意事情

  異常

  結果描述

  原因分析

  對策

  白板

  顯色步驟結束后，酶標板所有孔均無顏色。陽性對照不顯色。

  試劑已過效期，或不同試劑盒組分混用

  檢查試劑的組分及批號，確認未過期以及所有組分均屬對應的試劑盒。不同試劑盒或不同批號的試劑不能混用。

  錯加、漏加試劑底物、顯色劑A或B

  嚴格按說明書的步驟操作，加完試劑后可觀察一下液面高度是否一致，以減少漏加現象。

  洗板及加樣過程中，酶標受污染失活失去催化顯色劑顯色的能力

  確認盛酶標的容器不含酶抑制劑如疊氮鈉等，確認配制洗液的容器已洗干凈。

  終止液誤作洗滌液稀釋或當底物緩沖液配制

  每次配制時都應看清標簽標明物質。

  蒸餾水有問題

  確認配制洗液的純化水達到要求且未污染，與好蒸餾水比較。

  顯色弱、靈敏度低

  實驗結束后，包括陽性對照、質控在內的所有板孔顏色均較淡。

  試劑盒超過期，超過有效期的產品可能會產生很弱的信號;試劑盒沒有按規定進行保存，受高溫影響;

  實驗前檢查試劑的組分及批號，確認試劑未過期。不要將試劑盒長時間置于常溫下，按使用規定儲藏。

  試劑、樣品用前未平衡至室溫

  從低溫冰箱中取出的試劑及樣品應置室溫平衡20分鐘左右。

  加入試劑的體積和時間有誤，移液器計量不準，吸嘴內水分太多或不清潔;

  確定所使用的試劑體積正確，加入時間適當。校正移液器，移液器與吸嘴配合要緊密吻合。移液不宜太快，排放應完全。

  洗板及加樣過程中，酶標受污染失活而失去催化顯色劑顯色的能力;

  確認盛酶標的容器不含酶抑制劑如疊氮鈉等，確認配制洗液的容器已洗干凈，確認配制洗液的純化水達到要求且未受污染。

  孵育時間及孵育溫度未達到要求，反應板放入培養箱時注意溫度并及時調整。

  孵育溫度應控制在37-38℃，孵育時間嚴格按照說明書操作。保溫期內不宜多開門，以免影響保溫。

  洗板次數過多，或濃縮洗液稀釋倍數不符合要求;洗滌沖擊力太大。浸泡時間太長;

  嚴格按說明書要求稀釋濃縮洗液及洗板，減小洗滌沖擊力，按說明書要求置留洗滌液時間和洗滌次數。

  顯色劑加量不足或順序顛倒，或混合后加入;

  顯色劑滴瓶垂直向下，持力均勻，滴速不宜過快，先加顯色劑A，后加顯色劑B，不可將A、B液混合后加入。

  底物作用時間不夠;

  準確定時。

  蒸餾水水質有問題;

  測定蒸餾水配制試劑對酶免疫法的影響。

  實驗結束后，陰陽性對照正常，質控正常，但臨床標本感覺顯色較弱

  待測標本中可能不含強陽性標本，故結果可能是正常的

  如有懷疑，可復檢

  標本加入疊氮鈉作為防腐劑

  酶免實驗中的標本禁用疊氮鈉作為防腐劑，可選用proclin、硫柳汞等其他防腐劑

  陰陽性對照正常，但質控、參考品或個別弱陽性標本未能檢出。

  未達要求的孵育溫度及孵育時間可檢出強陽性標本，但質控或弱陽性標本受溫度變化影響較大而被未檢出。

  確認孵育的溫度及孵育時間達到要求。

  質控品或標本高溫放置過久，或被反復凍融致待測物滴度下降，而未能檢出

  質控品或標本避免反復凍融。標本在一周內使用的，可存于2-8℃，如需長期保存，應置于-20℃以下保存。質控品應小量分裝，并置于-20℃以下保存。

  儀器設定不正確，濾光片不匹配。

  重新設定酶標儀的參數，特別是檢查濾光片是否匹配。

  終止后，目測結果正常，但酶標儀讀值結果偏低

  酶標儀參數設定不正確。

  重新設定酶標儀的參數，特別是檢查濾光片是否匹配。

  靈敏度過高、板底高、高背景

  終止后，整板結果顯現均一的黃色或淡黃色;或陰陽性對照、質控正常，標本陰性標本OD值過高。

  整板的黃板現象可能是由于錯加其他試劑造成，如同時操作兩對半試劑時，測HbsAb板用于測HBsAg等;

  實驗前檢查試劑的組分及批號，確認所有組分均屬于對應的試劑盒。不同試劑盒或不同批號的試劑不能混用。

  酶標對吸頭的污染以及對盛放顯色劑容器的污染都易造成黃板現象;

  避免試劑組分間的交叉污染，確保吸頭、容器的干凈。

  顯色劑在光照條件下放置過久，實驗前已變藍

  顯色劑A、B未使用前避光保存

  孵育溫度過高或孵育時間過長;

  孵育溫度應控制在37-38℃，孵育時間嚴格按照說明書操作。

  未按要求洗板。特別是洗滌時每孔未注滿洗液，易造成花板黃板現象

  嚴格按說明書要求洗板。

  花板，一般是由于臨床標本的收集、處理和保存方法不當造成

  放置時間(自然放置1~2h)及離心轉速(3000r/min)、離心時間(15min)應引起注意。

  出現隨機性的花板、跳孔現象

  樣品離心不完全，反應孔內發生凝血或殘留細胞成分;

  充分離心，3000rpm6分鐘以上。

  加樣時交叉污染;

  加標本時盡量避免交叉污染。如盛標本的試管周圍常有血痂，易脫落，應遠離酶標板。

  手工洗板造成的交叉污染

  手工洗板時前3次注洗液后應立即棄去，后幾次再設定浸泡時間，可減少交叉污染

  洗板機加液頭堵塞導致加液不滿或吸液殘留量較大，造成花板、跳孔

  疏通加液頭，使洗板時每孔均注滿洗液，吸液時殘留量要小。

  拍板時交叉污染

  洗板完畢拍板時用合適的吸水紙巾，不要把無關物質拍進板孔，并盡量不要在同位置拍，以免交叉污染。

  假陽性

  假陽性現象是一個綜合現象，可參考上文“靈敏度過高、板底高、高背景"中的分析。這里只列舉常見的原因及對策。

  計算Cutoff值時使用的公式不正確，導致計算得出的CutOff值過低，從而導致出現假陽性

  CutOff值計算公式應嚴格參照所屬產品的說明書，應注意各個酶免產品的Cutoff值計算公式不盡相同。

  洗板時未能注滿洗液或洗板次數、浸泡時間不夠，洗滌不充分，樣品中有其他成分殘留導致花板、跳孔，假陽性增多

  嚴格按說明書要求洗板。調整洗板機時，應注意有時儀器標示的液量與實際液量并不相符，應根據實際情況調整至每孔注滿。

  血清標本處理不當，如未除去細胞成分、纖維蛋白原及其它干擾物可出現孔底由變藍的跳孔現象，此標本重復實驗結果往往是陰性;

  放置時間(自然放置1~2h)及離心轉速(3000r/min)、離心時間(15min)應引起注意。

  廠家試劑質量的變化造成;

  國家標準要求提高靈敏度時，廠家試劑靈敏度也相應提高，假陽率常常有所上升，但只要在合理范圍，是可以接受的。

  水質問題;

  防止蒸餾水污染。

  加酶量過多(如50uL誤認為100uL)或丙肝酶稀釋時加量過多;

  加酶前檢查移液器調節量是否準確，稀釋酶時思想要集中。

  培養箱溫度超過37℃或酶結合物反應時間或底物顯色時間超過;

  放入板以前要檢查培養箱的溫度，準確定時。

  底物配制時間過長、或底物污染;

  底物應在酶反應完畢即將洗滌前5分鐘配制，注意避光。

  該批樣品放置時間過長，樣品污染;

  樣品應保持新鮮，或低溫保存，防止污染。

  移液嘴重復使用，未洗凈或消毒不完全而用于加酶或底物;

  移液嘴盡可能一次性使用。

  重復性差

  1、樣品數量不一，加樣時間長短不一;

  重復某一樣品時，加樣時間盡可能與次接近。

  2、樣品加入后未混勻;

  加樣后在混勻器上充分混勻。

  3、酶標儀濾光片不對或輸入波長不對;

  TMB顯色用450/630波長.

  4、酶標儀測定重復性差;

  校對酶標儀。

  5、洗滌不正確;

  洗滌液注滿各孔但不要溢出。洗板時反應板面向下，垂直用力甩凈內容物(可多甩幾次)，在干凈、無或少塵的吸水材料上拍干。洗板機洗板時不應有堵孔，洗滌應充分。

  6、溫育條件不一致(一次用水育，一次用恒溫箱)

  恒溫箱溫育較水浴顯色深，OD值高出0.1-0.15,好均采用恒溫箱.如用水浴水溫應控制在37℃。

  7、不慎多加或少加酶或顯色劑;

  多加時顯色深，少加則淺，用記號筆圈上，便于分析。

  8、閾值附近時陰時陽;

  同一樣品做三個復孔，以二個(含二個以上相同結果為準)

  9、加樣量不足、保溫時間、洗滌條件一致;

  盡可能使用同一移液器和裝緊吸嘴重復測定標本。條件、人員等應盡量與上次保持一致。

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