ELISA通關(guān)丨常見問(wèn)題及解決方案
ELISA通關(guān)丨常見問(wèn)題及解決方案
一、為什么所有試劑和檢測(cè)樣本要平衡至室溫后再進(jìn)行加樣操作?
溫度是ELISA結(jié)合反應(yīng)的重要影響因素。為了使所有樣本在一致的溫度下反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)前務(wù)必將所有試劑平衡至室溫，包括檢測(cè)樣本。避免因溫度的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)差異而導(dǎo)致ELISA檢測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確。
二、如何獲得良好線性的標(biāo)準(zhǔn)曲線?
按照推薦方式保存標(biāo)準(zhǔn)品;溶解標(biāo)準(zhǔn)品之前需短暫離心，徹底收集粉末;確保標(biāo)準(zhǔn)品完全溶解和混勻(大約10min)，然后再進(jìn)行后續(xù)的系列稀釋步驟，確保每一步都充分混勻且移液;顯色的恰當(dāng)終止;選擇合適的數(shù)學(xué)擬合方程繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
三、ELISA實(shí)驗(yàn)為什么必須設(shè)置復(fù)孔?
為獲得準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，強(qiáng)烈建議標(biāo)準(zhǔn)品及樣本進(jìn)行復(fù)孔檢測(cè)。因?yàn)閺?fù)孔檢測(cè)可以：
計(jì)算平均值，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確;
解決實(shí)驗(yàn)中誤操作造成的跳孔現(xiàn)象;
計(jì)算CV值，對(duì)實(shí)驗(yàn)的操作和試劑盒的度進(jìn)行評(píng)估。
四、為什么實(shí)驗(yàn)過(guò)程中孵育、洗滌需要振蕩?如何振蕩?
振蕩孵育使反應(yīng)充分，振蕩洗滌使背景干凈。建議使用酶標(biāo)專用96孔微孔板振蕩器。
孵育過(guò)程振蕩，可以加快、加強(qiáng)抗原抗體分子間的相互碰撞接觸，使得反應(yīng)過(guò)程加完全，OD值通常會(huì)比未振蕩孵育的結(jié)果要高;洗滌過(guò)程振蕩，可以使洗板干凈，在很大程度上 能降低背景值，同時(shí)可以提高試劑盒檢測(cè)的靈敏度。
五、何時(shí)終止ELISA反應(yīng)?
ELISA實(shí)驗(yàn)終需要酶催化底物顯色反應(yīng)來(lái)完成，在佳時(shí)間終止反應(yīng)是ELISA實(shí)驗(yàn)成功的重要因素。在HRP-TMB酶促反應(yīng)系統(tǒng)中，S5出現(xiàn)淡藍(lán)色，S1 – S3有明顯的階梯型藍(lán)色，便需要終止反應(yīng);或者根據(jù)高濃度標(biāo)準(zhǔn)品孔在620nm的OD值來(lái)決定，OD620=0.9-0.95之間時(shí)即可終止。
六、為什么酶標(biāo)儀讀數(shù)時(shí)必須選用雙波長(zhǎng)?
首先，酶標(biāo)儀使用前務(wù)必預(yù)熱10-15min，使測(cè)讀結(jié)果穩(wěn)定。其次，ELISA實(shí)驗(yàn)采用雙波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，可以排除單波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)的測(cè)定干擾(標(biāo)本的濃度，干擾色等)。一般采用大波長(zhǎng)作為參照波長(zhǎng)，在參照波長(zhǎng)下，檢測(cè)物的吸光值小，檢測(cè)波長(zhǎng)和參照波長(zhǎng)的吸光值之差可以消除非特異性吸收;因此，雙波長(zhǎng)測(cè)定，可大限度的消除指紋、雜質(zhì)及不透光的物質(zhì)對(duì)酶標(biāo)儀讀數(shù)帶來(lái)的誤差，以保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度。
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